镇江香醋酿造过程中种子醅的优化

李信，余永建，朱胜虎，张俊红，赵迪，姚清

(江苏恒顺醋业股份有限公司，江苏 镇江，212000)

镇江香醋酿造过程中种子醅的优化

李信，余永建*，朱胜虎，张俊红，赵迪，姚清

(江苏恒顺醋业股份有限公司，江苏 镇江，212000)

镇江香醋的醋酸发酵采用传统套醪方式进行接种，是镇江香醋酿造的重要环节，直接决定了产品的品质。对不同季节的不同种子醅中醋酸菌的相对丰度和乙醇脱氢酶活性进行分析，并将其接种到新的醅池中进行醋酸发酵，通过研究接种后醋醅的温度、总酸及不挥发酸含量的变化，以此获得最佳种子醅。结果表明，春季和秋季，镇江香醋酿造过程最佳种子醅为第7天的醋醅；夏季和冬季，最佳种子醅分别为第6天和8天的醋醅。最佳种子醅中醋酸菌的相对丰度高，乙醇脱氢酶活性强，对提高出醋率、降低成本、提高产品品质具有重要影响。

种子醅；醋酸菌；乙醇脱氢酶； 醋酸发酵；优化

镇江香醋作为我国四大名醋之一，是我国传统固态酿造食醋的典型代表，其“固态分层发酵工艺”是我国宝贵的民族文化遗产，2006年“镇江恒顺香醋酿造技艺”被列入首批国家级非物质文化遗产名录。镇江香醋以优质江南糯米为主要原料，依靠天然多菌种混合发酵体系，结合传统的固态分层发酵工艺，先后经过40多道工序，最终生产出独具“酸而不涩，香而微甜，色浓味鲜，愈存愈鲜”特色的镇江香醋[1]。

镇江香醋的醋酸发酵时间为18～21 d，发酵过程中醋醅(醋醅指醋酸发酵过程中各原辅料及微生物的混合物)的温度维持在40～45 ℃，含水量约60%～70%。镇江香醋的醋酸发酵采用传统套醪的方式进行接种，即将麸皮、稻壳和酒精醪液充分混合均匀之后，将上一批次发酵至一定时间的醋醅作为种子(即种子醅)，接入下一批新鲜混匀的醋醅中进行扩大培养。百年来，镇江香醋的醋酸发酵一直延续套醪接种，此生产过程中不接种任何外源微生物，在长期的醋醅环境中驯化而形成的微生物群落结构是形成镇江香醋独特风味的重要因素。有研究表明[2]，在套醪接种过程中，醋醅中的主体微生物群落结构基本保持稳定，这也从科学的角度解释了镇江香醋采用传统套醪接种方式其产品品质保持稳定的原因。

江苏省镇江市为北亚热带季风气候，四季分明，但不同季节的镇江香醋酿造均采用发酵至第7天的醋醅作为种子醅，该种子醅的确定由车间师傅以口头的方式代代相传而来，缺乏科学的依据和深入的研究。目前，在国内外关于镇江香醋酿造过程种子醅的优化研究尚未见报道。因此，本课题针对不同季节的不同种子醅进行研究并对其进行优化，为镇江香醋套醪接种时种子醅的选择提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

种子醅：取自镇江香醋酿造车间；细菌基因组提取试剂盒：美国MO BIO Laboratories；溶菌酶：北京索莱宝生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

电泳仪、凝胶成像仪，美国伯乐公司；漩涡混合仪，赛默飞世尔(中国)有限公司；高速冷冻离心机，艾本德(上海)国际贸易有限公司；紫外分光光度仪，美国瓦里安公司；电子天平、精密pH计，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；生化培养箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；水浴锅，上海精宏实验设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 种子醅的取样

取样季节：春季(2015年4月)、夏季(2015年7月)、秋季(2015年10月)、冬季(2016年1月)。

取样时间：发酵时间为5、6、7、8、9 d的醋醅。

取样数量：各取3份作为平行样，每份样品从不同的醅池中取样。

取样方式：翻醅前，醅池的中间位置，从表层依次向下至深度40cm均匀取样至无菌桶中，混合均匀后备用。

用途：1份留存于-80 ℃冰箱，用于细菌基因组的提取；另1份作为种子醅，接种到新的醅池中进行醋酸发酵。

1.3.2 细菌基因组的提取与测序

准确称取1 g醋醅样品置于无菌研钵中，加入液氮快速研磨至粉末状，按照细菌基因组提取试剂盒中的说明对醋醅中的细菌基因组DNA进行提取。提取结束后，用1.0 g/100 mL的琼脂糖凝胶电泳对所提取的细菌基因组DNA进行检测[3]。

检测合格后，送至上海美吉生物医药科技有限公司，利用Illumina Miseq PE300平台进行细菌基因组的16S rRNA测序分析，每个样品至少提供2万条测序数据，其中引物序列为338F：5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’和806R：5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’。

1.3.3 乙醇脱氢酶测定

采用瓦勒-霍赫法测定乙醇脱氢酶活性[4-5]。

1.3.4 温度测定

采用温度计直接测定醋醅的温度，测量深度为30 cm，不同醅池测量深度相同。

1.3.5 总酸含量测定

采用氢氧化钠标准溶液滴定法测定，参照《GB/T 18623—2011》。

1.3.6 不挥发酸含量测定

采用蒸馏收集，氢氧化钠标准溶液滴定法测定，参照《GB/T 18623—2011》。

2 结果与分析

2.1 种子醅中醋酸菌相对丰度的测定

醋酸菌是镇江香醋酿造过程中最重要的微生物，主要以巴斯德醋杆菌为主。醋酸菌的相对丰度是选择种子醅的重要指标之一。本研究对不同季节的不同种子醅 (第5天、第6天、第7天、第8天、第9天)中醋酸菌相对丰度进行测定，结果如图1所示。

由图1可知，不同发酵时间的种子醅中醋酸菌的相对丰度具有明显的差异，随着发酵时间的延长均会出现先升高后降低的趋势。发酵起始阶段营养物质丰富，随着发酵时间的延长醋酸菌的数量迅速增加，当达到一定的丰度以后，随着营养物质的逐渐消耗，代谢产物的积累，部分醋酸菌的增殖速度降低，并出现死亡、裂解的现象，与此同时其他微生物出现一定程度的增殖，导致醋酸菌的相对丰度逐渐降低。

图1 不同季节的不同种子醅中醋酸菌的相对丰度Fig.1 The relative abundance of acetobacter in different starter solid-state vinegar culture

从图1还可以看出，不同季节的种子醅中醋酸菌相对丰度也有差异。春季和秋季，种子醅中醋酸菌的相对丰度均在第7天达到最高，分别为21.11%和21.07%，此时醋酸菌在整个菌群中的优势程度最高；夏季，第6天的种子醅中醋酸菌的相对丰度最高，达到20.01%；冬季，醋醅中醋酸菌达到最高相对丰度的时间较长，于第8天达到最高，但相对丰度值也最大，为21.92%，原因可能与冬季气温较低，醋酸菌启动发酵的时间延长，且低温导致杂菌增殖速度慢、数量偏低有关。

WANG等人[2]在研究镇江香醋醋酸发酵过程中微生物的动态变化时发现，随着发酵时间的延长，醋酸菌的相对丰度逐渐增加，直至发酵结束，该结论与本研究结果不符，其原因主要在于取样深度的不同，本研究仅取中上层的醋醅进行研究，而WANG等人从表层取至底部。此外，有研究表明[6]，醋酸发酵前期醋酸菌的生物量呈逐渐上升趋势，第 7天时达最高生物量，然后逐渐减低，与本研究结果相似，但不同季节、不同位置的醋醅中醋酸菌含量及水分含量均具有一定的差异，对醋醅中的微生物进行绝对定量时有一定的偏差。

2.2 种子醅中乙醇脱氢酶的测定

在醋酸发酵过程中，醋酸菌通过乙醇脱氢酶(ADH)将乙醇氧化成乙醛，然后再通过乙醛脱氢酶(ALDH)将乙醛氧化成醋酸[7]，其中前者尤为重要[8]。ADH的活性是衡量种子醅活力的重要的指标之一[9]，通过测定ADH活性，可以预测菌株的发酵能力，保证生产顺利进行。本研究对不同季节的不同种子醅中ADH的活性进行测定，结果如图2所示。

图2 不同季节的不同种子醅中ADH的活性Fig.2 The alcohol dehydrogenase in different starter solid-state vinegar culture

由图2可以看出，不同季节的不同种子醅中ADH活性具有一定的差异，变化规律与醋酸菌的相对丰度基本保持一致。春季和秋季，第7天的种子醅中ADH活性最高；夏季和冬季，种子醅中ADH活性最高值分别出现在发酵的第6天和第8天。研究表明[10-11]，ADH活性最高的醋酸菌可以产生更高浓度的酸，且ADH的活力与醋酸菌的产酸速率有明显的相关性，即产酸速率随着ADH活力的升高而升高。

2.3 接种后醋醅温度的测定

套醪接种后醋醅的温度是醋酸发酵过程中的重要指标，尤其是发酵前期对醋酸发酵有重要影响。高品质的种子醅可快速提高醋醅的温度，醋酸菌生长旺盛，产酸快，迅速抑制杂菌的生长，可提高产率和产品品质。本研究将不同季节的不同种子醅按照镇江香醋传统套醪接种的方式进行接种，然后测定接种后各组在发酵过程中的温度变化，结果如图3所示。

图3 不同季节接种不同种子醅后醋醅温度变化Fig.3 The changes of temperature in different vinegar culture

由图3可以看出，接种不同季节的不同种子醅后，醋醅温度的变化趋势基本相同。发酵初期(1～8 d)醋醅温度迅速上升至45 ℃左右；发酵中期(9～14 d)温度趋于平稳，基本保持在44～46 ℃，发酵后期(15～18 d)，醋醅温度逐渐下降。

不同季节的不同种子醅接种后，发酵初期醋醅温度升高的速度具有一定的差异。春季，第7天种子醅的升温速度最快；夏季，第6天种子醅的升温速度最快；秋季，第7天种子醅的升温速度最快；冬季，第8天种子醅的升温速度最快。温度升高速度越快，说明该种子醅的活力较强，醋酸菌的增殖速度快，这与醋酸菌的相对丰度高、ADH活性强的结果相一致。

2.4 接种后醅卤中总酸和不挥发酸的测定

醅卤是醋酸发酵期间从醋醅中渗透到发酵池底部的液体，因醋酸及其他有机酸等代谢产物易溶于水，且能比较均匀的分布在醅卤中，因此通过检测醅卤的总酸和不挥发酸可以评价醋酸发酵的产酸率和质量，是判断发酵质量的重要指标之一。将不同季节的不同种子醅按照镇江香醋传统套醪接种的方式进行接种后，测定各组醅卤中的总酸和不挥发酸含量，结果如图4和图5所示。

图4 不同季节接种不同种子醅后醅卤中总酸变化Fig.4 The changes of total acid in different vinegar culture

在醋酸发酵过程中，各组醅卤中总酸的变化趋势相同，随着发酵的进行总酸含量逐渐增加，最后趋于平稳，其中第1～10天的总酸含量上升速度最快。不同季节的不同种子醅接种后醅卤中总酸含量最高，产酸速度最快的分别为：春季，接种第7天种子醅的醅卤；夏季接种第6天种子醅的醅卤；秋季接种第7天种子醅的醅卤；冬季接种第8天种子醅的醅卤。最佳的种子醅产酸速度快，对杂菌的抑制作用强，原料利用率高，提高产品出率，对生产具有重要影响。

不挥发酸是镇江香醋风味的重要组成部分，是镇江香醋品质的重要指标之一。由图5可以看出，不同季节的不同种子醅接种后醅卤中不挥发酸的变化趋势基本相同，且不挥发酸含量无明显的差异，说明不同季节的不同种子醅对镇江香醋酿造过程中不挥发酸含量的影响较小。此外，各组种子醅接种后醅卤中不挥发酸含量出现先升高后降低的趋势，原因可能是在发酵初期醋醅底部处于厌氧状态，部分乳酸菌等厌氧微生物产生大量乳酸等不挥发酸，而随着翻醅的进行，氧气含量逐渐增加，乳酸菌等厌氧微生物菌的生长、代谢受到抑制，且产生的部分有机酸被其他微生物代谢利用(如醋酸菌会代谢利用部分乳酸)，从而使不挥发酸的含量出现一定程度的降低。

图5 不同季节接种不同种子醅后醅卤中不挥发酸变化Fig.5 The changes of non-volatile acid in different vinegar culture

3 结论

(1)春季和秋季，镇江香醋酿造过程中的最佳种子醅为第7天的醋醅；夏季，最佳种子醅为第6天的醋醅；冬季，最佳种子醅为第8天的醋醅。

(2)不同季节、不同发酵时间的种子醅对镇江香醋的酿造均具有一定的影响，可以按照季节的不同选取不同的种子醅，最佳的种子醅可以提高产酸速度，增加产品出率、降低生产成本、提高产品品质，对生产具有重要影响。

(3)相关种子醅的使用对产品的风味是否具有一定的影响，后续需进一步研究。

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Optimization of starter solid-state vinegar culture acetic fermentation of Zhenjiang aromatic vinegar

LI Xin, YU Yong-jian*, ZHU Sheng-hu, ZHANG Jun-hong, ZHAO Di, YAO Qing

(Jiangsu Hengshun Vinegar industry Co., Ltd.，Zhenjiang 212000, China)

A cycle-inoculation technique is used for the production of Zhenjiang aromatic vinegar, this technique is important to the acetic fermentation of Zhenjiang aromatic vinegar since it directly determines the quality of products. The relative abundance of acetobacter and alcohol dehydrogenase in different starter solid-state vinegar culture were analyzed. The culture from the last batch was taken as the starter for the new batch, and the changes of temperature, total acid and non-volatile acid in the new batch were studied. In this research it was found that the optimum starter solid-state vinegar culture fermentation time was 7th day in spring and autumn, the optimum starter solid-state vinegar culture fermentation time was 7th day in summer, and the optimum starter solid-state vinegar culture fermentation time was 8th day in winter. The optimum starter solid-state vinegar culture has maximum relative abundance of acetobacter and alcohol dehydrogenase. The optimum starter solid-state vinegar culture has a major impact on the quality of vinegar.

starter solid-state vinegar culture; acetobacter; alcohol dehydrogenase; acetic fermentation; optimization

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201703020

硕士研究生，工程师(余永建研究员级高级工程师为通讯作者,E-mail：hsjszx@aliyun.com)。

江苏省博士后科研资助计划(1501137C)

2016-10-11，改回日期：2016-11-24