四逆散有效组分对慢性情绪应激所致大鼠睡眠障碍的改善作用研究

叶晓楠，陈光，卞宏生，李廷利

(黑龙江中医药大学,黑龙江 哈尔滨 150040)

四逆散有效组分对慢性情绪应激所致大鼠睡眠障碍的改善作用研究

叶晓楠，陈光，卞宏生，李廷利*

(黑龙江中医药大学,黑龙江 哈尔滨 150040)

目的：基于空瓶刺激诱发慢性情绪应激所致大鼠睡眠障碍模型来研究四逆散有效组分是通过调整负性情绪来实现其改善睡眠的作用。方法：SD大鼠24只，随机分为空白对照组、模型组、阳性药物对照地西泮组(1 mg/kg)、四逆散有效组分组(450 mg/kg)，每组6只。以空瓶刺激法建立情绪应激模型。在模型复制的第2周开始灌胃给药，共灌胃7 d。观察四逆散有效组分对慢性情绪应激大鼠的攻击行为、睡眠时间、睡眠-觉醒节律，全脑TNF-α含量的影响。结果：与空白对照组比较，模型组大鼠的攻击行为显著增多(P<0.01)，全天睡眠时间显著减少(P<0.05)，全脑TNF-α水平显著降低(P<0.01)；与模型组比较，四逆散有效组分可使攻击行为显著减少(P<0.05)，全天睡眠时间显著增多(P<0.05)，全脑TNF-α水平显著增高(P<0.05)。结论：四逆散有效组分可通过改善负性情绪来实现其改善睡眠的作用，对全脑TNF-α水平的调节可能是其作用的机制之一。

空瓶刺激;应激;负性情绪;睡眠障碍;细胞因子

随着社会的进步、生活节奏的加快、社会压力的增加，心理应激性失眠的患病率逐年升高[1]。事实上，失眠不仅是一个睡眠生理的紊乱过程，同时还是一种心理紊乱的过程[2]。中医理论对失眠病因的解释多是基于情绪所致心神不安，四逆散临床治疗失眠主要适用于肝郁气滞型，其主旨病证也主要与情志紊乱导致失眠有关。实验室前期研究证明四逆散及其有效组分并无催眠作用，但是却能特异性延长正常或睡眠剥夺大鼠的深睡时间[3]，认为四逆散及其有效组分可能是通过调整负性情绪来实现其改善睡眠的作用。基于上述观点，本实验采用空瓶刺激来作为慢性情绪应激睡眠障碍的动物模型[4]，以大鼠的攻击行为、睡眠时间、睡眠-觉醒节律、全脑TNF-α含量为观察指标，研究四逆散有效组分改善睡眠的作用及作用机制，为临床应用四逆散治疗失眠提供实验根据。

1 材料和方法

1.1 动物

SD大鼠24只，雄性，体质量(220±20)g，SPF级(由黑龙江中医药大学药物安全性评价中心GLP实验室提供，许可证号：P00700619号)。饲养环境为通风、避光、隔音、屏蔽状态，采用自动定时光控系统对大鼠的生活环境实行明暗光照周期处理(12 h照明/12 h黑暗，每天早上7时开始照明)，室温：(24±2)℃，相对湿度：50%～60%，噪声≤40 dB，光照强度：300 lux。

1.2 药物及试剂

四逆散有效组分辛弗林(HPLC>98%，批号：CAS 5985-28-4)，芍药苷(HPLC>98%，批号：MUST-13113009)，柴胡皂苷C(HPLC>98%，批号：MUST-13101013)，甘草次酸(HPLC>98%，批号：CAS 471-53-4)，均购于成都思科华生物技术有限公司，其构成比例为：辛弗林:芍药苷:柴胡皂苷C:甘草次酸=8:1:1:5，加入含有2%吐温-80的生理盐水配置成浓度为66 mg/mL的混合溶液，备用。地西泮(2.5 mg/片，由石药集团欧意药业有限公司生产，生产批号：国药准字H13020973)加生理盐水配置成适当浓度的混合溶液备用。TNF-α酶联试剂盒(美国R&D公司，批号：20151019A)。

1.3 仪器

酶标仪(美国BIO TEK公司，型号：Synergy MX),高速低温冷冻离心机(美国TOMOS公司，型号：3-18R),移液枪(Effendorf AG),电动玻璃匀浆机(宁波新芝生物科技股份有限公司，型号：DY89-II),实验动物监测系统(美国COLUMBUS公司，型号：CLAMS),动物行为视频分析系统(上海欣软，型号：Super Maze)。

1.4 方法

1.4.1 分组、模型复制及给药

选取SD大鼠24只，随机分为4组，即空白对照组(C)，模型组(ES)，阳性药物对照地西泮组(DZP)、四逆散有效组分组(SNS)，每组6只。动物适应环境7天，每天抚摸动物5 min，使大鼠适应抓持。适应环境结束后开始10 d的定时给水训练，仅每天早9:00～9:10和晚21:00～21:10给予饮水，其余时间不给水。于第18天开始持续2周的空瓶刺激，空白对照组大鼠仍每天固定时间给予饮水两次，模型组、阳性药物对照组、四逆散有效组分组大鼠给予空瓶刺激诱发情绪应激，刺激的给予是无规律的，每天1次或每天2次，此情绪应激在连续的2周内给予14次，每次10 min(刺激安排见表1)。所有动物自由饮食。在空瓶刺激造模开始的第2周起每天早上8:00灌胃给药，四逆散有效组分组动物灌胃给予四逆散(450 mg/kg)，阳性药物对照组大鼠灌胃给予地西泮(1 mg/kg)[5]，空白对照组和模型组动物灌胃给予等体积的生理盐水(实验流程见图1)。

表1 持续14天空瓶刺激安排表

注：N：正常饮水;ES：空瓶刺激

图1 灌胃实验流程

1.4.2 行为学分析

利用动物行为视频分析系统记录各组大鼠在给予刺激的10 min内的行为表现，将空瓶刺激的10 min等分为10个时间段，在每个时间段内记录每只大鼠的攻击行为(撕咬或攻击空瓶和笼子)。行为出现即为1，否则为0。统计10 min内行为的总分(总分在0～10分之间)。14个观察日中每间隔3天的平均分用于统计分析[6]。

1.4.3 睡眠监测

造模结束后将动物放入实验动物监测系统的有机玻璃笼中适应环境12 h，监测24 h内(早7:00～次日早7:00)动物的睡眠情况。通过动物撞击红外光束IR，判断动物活动次数(通常计算机每10 s采集1次数据，每天有8 640个采集点)，以活动次数为0，在活动阈值为30 s下，计算大鼠的24 h的睡眠时间[7]。监测期间，大鼠仅早9:00～9:10和晚21:00～21:10给予饮水。

1.4.4 取材及检测

睡眠监测结束后，断头取脑，小心取出全部脑组织。用冰生理盐水冲洗，滤纸拭干。将分离的脑组织用分析天平精确称量，然后分别加9倍量的冰生理盐水自动匀浆后在4℃、12 000 r/min下离心10 min。取上清液，待测。按试剂盒操作步骤处理后测得相应的吸光度(OD值)，再将OD值带入线性回归方程，计算各样品中TNF-α的含量。

1.5 统计学处理方法

2 结果

2.1 四逆散有效组分对空瓶刺激诱导的慢性情绪应激大鼠行为学的影响

表2 对慢性情绪应激大鼠行为学的影响±s，n=6)

注：与空白组相比,##P<0.01;与模型组相比,*P<0.05

见表2。与空白对照组相比，模型组大鼠的攻击行为增多，具有极显著差异(P<0.01)；与模型组相比，四逆散有效组分组大鼠攻击行为减少，具有显著性差异(P<0.05)；地西泮组的攻击行为也有下降的趋势，但无统计学意义。

2.2 四逆散有效组分对慢性情绪应激诱导的睡眠障碍大鼠睡眠时间的影响

见表3。与空白对照组相比，模型组大鼠全天睡眠时间显著减少(P<0.05)，两者间存在显著差异。与空白对照组相比，模型组大鼠夜晚睡眠时间极显著减少(P<0.01)，两者间存在极显著差异;与模型组相比，地西泮组大鼠全天的睡眠时间极显著增多(P<0.01)，两者间存在极显著差异；与模型组相比，四逆散有效组分组大鼠全天睡眠时间显著增多(P<0.05)，两者间存在显著差异；与模型组相比，地西泮组大鼠夜晚的睡眠时间显著增多(P<0.05)，两者间存在显著差异；与模型组相比，四逆散有效组分组大鼠夜晚睡眠时间显著增多(P<0.05)，两者间存在显著差异。

表3 对大鼠睡眠时间的影响±s，n=6)

注：与空白对照组相比,#P<0.05,##P<0.01;与模型组相比,*P<0.05,**P<0.01

2.3 四逆散有效组分对慢性情绪应激诱导的睡眠障碍大鼠睡眠-觉醒节律的影响

见图2。各组SD雄性大鼠的睡眠-觉醒呈现昼夜节律变化。表现为作为夜行动物，大鼠白天较多处于睡眠状态，夜晚较多处于觉醒状态，且睡眠呈现片段化。

各组大鼠在早9:00的时间点睡眠时间减少，均出现高活动状态。与空白对照组相比，模型组大鼠早9:00给水后，恢复睡眠的较快，睡眠的片段化明显；而地西泮和四逆散有效组分组进入睡眠的时间较长，睡眠的片段化不明显，有整合的趋势。

在晚21:00给水后，与空白对照组相比，模型组大鼠的活动较多，睡眠较少，恢复睡眠的较慢，睡眠呈现片段化；而地西泮和四逆散有效组分组虽进入睡眠的时间较长，但睡眠的片段化有整合的趋势。

图2 对大鼠睡眠-觉醒节律的影响注:此图分别显示空白对照组(C)，模型组(ES)，阳性药物对照地西泮组(DZP)、四逆散有效组分组(SNS)造模后大鼠连续24h的睡眠-觉醒情况。图中最上方的白和黑水平条表示光暗循环的持续时间，白色条部分为主观白昼，时刻为7:00-19:00，黑色条为主观夜晚，时刻为19:00-7:00；图内黑色部分表示大鼠处于睡眠状态，白色部分表示大鼠处于觉醒状态；图上的2条标记线分别表示给水的操作时间即早9:00和晚21:00

2.4 四逆散有效组分对慢性情绪应激诱导的睡眠障碍大鼠全脑TNF-α含量的影响

表4 对大鼠全脑TNF-α含量的影响

注：与空白对照组相比,##P<0.01；与模型组相比,*P<0.05

见表4。与空白对照组相比，模型组TNF-α含量降低(P<0.01)，具有极显著性差异；与模型组相比，地西泮组和四逆散有效组分组TNF-α含量升高(P<0.05)，具有显著性差异。

3 讨论

本实验基于实验室的前期研究成果，开展了空瓶刺激诱导慢性情绪应激所致大鼠睡眠障碍及四逆散有效组分干预作用的相关研究工作。

其中诱发情绪应激导致动物睡眠障碍是实验的难点之一。“情绪是什么”这一问题是自1884年美国心理学奠基人威廉詹姆斯提出之后，至今仍没有得出一个一致性的结论。目前学术界比较公认的观点为，情绪是人对客观事物的态度体验及相应的行为反应[8]。情绪状态包括四个方面：认知、感受、生理变化和行为。在实验室中，情绪的测量主要依靠以下三种方法：自我报告、生理测量和行为反应[9]。自我报告是指被试者对自我情绪感受的描述，也可以报告自己的认知、行为以及情绪的其他方面；生理测量包括对血压、心率、出汗以及其他随情绪唤醒而波动的变量的测量；行为反应是指可观测的行动，包括面部和声音表达、逃跑或攻击。在研究非人类动物或还不会说话的婴儿的情绪时必须依赖行为观察。攻击作为行为失控的产物，与负性情绪关系密切[10]。越来越多的研究结果表明情绪和睡眠之间有着紧密的联系，紧张、焦虑、恐惧等负性情绪会引起睡眠障碍，而睡眠障碍本身又可导致负性情绪的产生，周而复始形成恶性循环[11]。本研究利用空瓶刺激来诱发大鼠产生负性情绪，以攻击行为作为大鼠表达负性情绪的指标，以睡眠时间、睡眠-觉醒节律作为评价睡眠的标准，发现空瓶刺激可以引起模型组大鼠明显的攻击行为并减少大鼠的全天睡眠时间，睡眠的片段化明显，证明负性情绪诱发睡眠障碍的模型复制成功。

四逆散具有透邪解郁，疏肝理气之功，是临床上治疗情志紊乱导致失眠的首选方剂[12-13]。本研究表明四逆散有效组分具有一定的改善负性情绪的作用，可以使接受空瓶刺激的大鼠攻击行为减少，并且效果优于地西泮。且具有改善空瓶刺激诱导大鼠睡眠障碍的作用，主要表现为与模型组相比，四逆散有效组分可使接受空瓶刺激的大鼠全天睡眠时间增多，并且主要增多的是大鼠夜晚的睡眠时间。并初步探讨了其作用机制，与大鼠全脑TNF-α的含量升高有关。研究发现TNF-α是一种能促进睡眠的前炎性细胞因子，静脉或脑室注射外源性细胞因子TNF-α可诱发睡眠[14]，通过不同机制影响中枢神经系统的睡眠过程。

另外，在通过对大鼠睡眠-觉醒节律的研究中，我们发现利用空瓶刺激诱导大鼠睡眠障碍的造模特点，是早9点或晚21点给水，大鼠对这种定时给水会有一种前瞻性，人为的改变大鼠的饮水规律，使大鼠的睡眠-觉醒节律发生变化，分别在早上9点和晚上21点出现了高活动状态，尤其是早上9点，模型组大鼠的睡眠时间显著减少，在节律图上出现了一个空白的区域。对于造成这种现象的原因，笔者考虑其一是由于空瓶刺激给大鼠造成了负性情绪，这种负性情绪影响了大鼠的睡眠；其二人为定时给水训练让大鼠习惯早9点晚21点饮水，生理缺水促使大鼠找水，而使大鼠在给水的时间点出现活动的高峰，睡眠时间减少，但是空瓶刺激并未使大鼠昼夜节律发生偏移，同时模型组大鼠睡眠的片段化明显，而地西泮和四逆散有效组分组大鼠睡眠的片段化有整合的趋势，有益于睡眠。

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Active Compounds of Sinisan for Improving Sleep Disorder ofRats with Chronic Emotional Stress

YE Xiao-nan, CHEN Guang, BIAN Hong-sheng, LI Ting-li

(HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China)

Objective: To study the effect of Sinisan on sleep disorder of rats with chronic emotional stress induced by the empty bottle stimulation. Methods: Twenty- four male SD rats were randomly divided into four groups (six rats in each group), empty bottle stimulation group, blank control group, diazepam positive control group diazepam (1 mg/kg), Sinisan's active compounds treatment group (450 mg/kg). The chronic emotional stress rats (model) group was established by empty bottle stimulation for 2 weeks. On the 2nd week after empty bottle stimulation, the treatment groups were treated by the corresponding medicine once a day for 7 days by lavage after the model establishment. Observe the effect of Sinisan's active compounds on aggressive behaviors, sleep time, sleep-wake rhythm, and the whole brain TNF-α level. Results: Compared with those in the control group, the aggressive behaviors of rats in the model group was significantly increased (P<0.01), and it was significantly reduced in sleep time (P<0.05) and the whole brain TNF-α level (P<0.01). Compared with empty bottle stimulation group, Sinisan treatment group showed a significant reduction in aggressive behaviors (P<0.05), while the sleep time and the whole brain TNF-α level were significantly increased (P<0.05). Conclusion: The active compounds of Sinisan can improve sleep disorder by way of improving the negative emotion and one of its mechanisms is through TNF-α regulation for the brain.

Empty bottle stimulation; Stress; Negative emotion; Sleep disorder; Cytokines

2016-02-28

2016-10-31

国家自然科学基金面上项目(87214114);黑龙江中医药大学博士创新基金(2015bs08)

叶晓楠(1990-),女,硕士研究生,主要从事天然药物及复方生物活性的研究。

*通讯作者：李廷利(1957-)男,教授,博士研究生导师，主要从事天然药物及复方生物活性的研究。

R285.5

A

1002-2392(2017)02-0006-04