六味地黄丸改善脑瘫模型大鼠运动功能的实验研究

高长玉,李冀,李博文,姜志梅

(1.黑龙江省小儿脑性瘫痪防治疗育中心博士后科研工作站,黑龙江 佳木斯 154003;2.黑龙江中医药大学,黑龙江 哈尔滨 150040)

六味地黄丸改善脑瘫模型大鼠运动功能的实验研究

高长玉1,2,李冀2,李博文2,姜志梅1*

(1.黑龙江省小儿脑性瘫痪防治疗育中心博士后科研工作站,黑龙江 佳木斯 154003;2.黑龙江中医药大学,黑龙江 哈尔滨 150040)

目的：研究六味地黄丸对脑瘫模型大鼠运动功能的影响，探讨其作用机理。方法：采用孕鼠腹腔注射脂多糖(LPS)合并缺氧方法制作脑瘫动物模型，通过悬吊试验、斜坡试验与模型大鼠脑组织乙酰胆碱酯酶(ACHE)含量的检测，观察六味地黄丸对其的影响。结果：六味地黄丸能够明显延长模型大鼠悬吊时间，缩短斜坡试验耗时，提高模型大鼠脑组织AchE的含量，差异具有统计学意义(P<0.05)。结论：六味地黄丸能够增强脑瘫模型大鼠运动能力，其机理可能与改善胆碱能神经系统功能有关。

脑瘫模型大鼠;六味地黄丸;运动功能;乙酰胆碱酯酶

小儿脑瘫(cerebral palsy,CP)是自受孕开始至婴儿期非进行性脑损伤和发育缺陷所导致的综合征，主要表现为运动障碍及姿势异常。国内外治疗脑瘫多以康复训练为主，配合中医针灸、按摩、熏洗、高压氧、药物、手术治疗等。本研究通过观察六味地黄丸对脑瘫模型幼鼠运动能力及脑组织中乙酰胆碱酯酶含量的影响，为中药治疗小儿脑瘫提供可参考的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

清洁级成熟Wistar雄性大鼠12只，雌性大鼠24只，体质量200～220 g，均由哈尔滨医科大学附属二院实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK(黑)2013-001。

1.1.2 实验药品与试剂

六味地黄丸浓缩丸(北京同仁有限责任公司，批号：15012157)；脂多糖(LPS)(血清型055∶B5，美国SIGMA公司)，大鼠乙酰胆碱酯酶(AchE)酶联免疫试剂盒(南京建成生物工程研究所)，8%氧气92%氮气混合气体(哈尔滨盛大气体公司)。

1.1.3 实验仪器

SpectraMax M2核酸酶标仪(美国Molecular Devices公司)，BX51荧光显微镜(日本奥林巴斯公司)，MIKRO22台式离心机(德国赫提驰公司)，自制缺氧箱。

1.2 方法

1.2.1 造模方法

将大鼠按雌雄比例2∶1合笼，于次日早晨7时对雌鼠进行阴栓检查并做阴道涂片，发现阴栓或查得精子，则记为妊娠0 d，孕鼠单独饲养。随机选取孕鼠15只分为造模组10只和对照组5只。在妊娠第16 d给造模组孕鼠腹腔注射LPS(450 μg/kg)，12 h后将孕鼠置于缺氧环境(8%O2和92%N2混合气体)2 h，6 h后再重复做1次。对照组孕鼠腹腔注射等剂量生理盐水[1-2]。

1.2.2 动物模型的筛选

将9日龄幼鼠进行神经行为学测试，参照蓝靖文[3]标准进行筛选，得到脑瘫模型大鼠。

1.2.3 实验分组

将所得模型大鼠随机选取30只，分为三组：中药治疗组、康复训练组、模型对照组，每组10只。另取10只正常等龄大鼠做为空白对照组。

1.2.4 治疗方法

给药方法：中药治疗组模型幼鼠按体质量灌服六味地黄丸混悬液，给药剂量根据临床用量，按照人与大鼠体表面积折算。模型对照组和空白对照组灌服等量生理盐水。各组连续灌服20 d。

康复训练方法：通过笼内释放有刺激性气味如白醋，风油精；放置各种颜色形状的物体，各种可以活动的“玩具”如跑轮、滑梯、管道、台阶、小球等进行丰富环境刺激与运动训练[4]。每日将幼鼠放入该笼中2次，每次30 min。同时多次抓取抚摸刺激幼鼠，连续刺激训练20 d。

1.3 观测指标

1.3.1 悬吊试验

距离桌面45 cm水平放置一根直径为0.5 cm的玻璃棒，使30日龄大鼠前爪抓住金属棒，后肢悬空，撤去助力时以秒为单位开始计大鼠悬吊在金属棒上的时间并记录。

1.3.2 斜坡试验

将大鼠头向下倒置于45°斜面上，记录大鼠扭转身体使头部向上，转至与原始头部方向夹角>135°的时间，以秒为单位。

1.3.3 AchE含量测定

按照AchE测定试剂盒说明书检测AchE含量。

1.4 数据处理

2 实验结果

2.1 悬吊试验

各组大鼠悬吊试验测试结果统计比较,见表1。

表1 悬吊试验测试结果±s)

注：与空白对照组比较,*P<0.01;与模型对照组比较,▲P<0.01;与康复训练组比较,●P<0.05

由表1可见，与空白对照组比较，模型对照组悬吊时间明显缩短，差异具有统计学意义(P<0.01)；与模型对照组比较，康复训练组与中药治疗组的悬吊时间明显延长，差异具有统计学意义(P<0.01)；与康复训练组比较，中药治疗组的悬吊时间明显缩短，差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.2 斜坡试验

各组大鼠斜坡试验测试结果统计比较,见表2。

表2 斜坡试验测试结果±s)

注：与空白对照组比较,*P<0.01;与模型对照组比较,▲P<0.05;与康复训练组比较,●P<0.05

由表2可见，与空白对照组比较，模型对照组斜坡试验耗时显著延长，差异具有统计学意义(P<0.01)；与模型对照组比较，康复训练组与中药治疗组耗时明显缩短，差异有统计学意义(P<0.05)；与康复训练组比较，中药治疗组耗时明显缩短，差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.3 对AchE含量的影响

各组AchE的含量统计结果,见表3。

表3 大鼠脑组织AchE测试结果

注：与空白对照组比较,*P<0.05;与模型对照组比较,▲P<0.05;与康复训练组比较,●P<0.05

由表3可见，与空白对照组比较，模型对照组AchE的含量明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型对照组比较，康复训练组与中药治疗组AchE的含量明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与康复训练组比较，中药治疗组AchE的含量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

中医学虽无脑瘫之病名，但古代医家对此早有深刻认识，将其归为“五迟”“五软”“五硬”等范畴，认为本病多由于先天禀赋不足、精髓不允，肾气亏虚所致，治疗当补肾填精益髓以强壮筋骨为核心法则[5-6]。本实验通过孕鼠腹腔注射LPS合并缺氧方法制作脑瘫动物模型，模型组大鼠出现反应迟钝、自主活动减少、运动速度缓慢、运动稳定性降低，悬吊试验、斜坡试验结果异常的现象，说明模型组大鼠肢体肌力与躯体平衡能力较差，存在随意运动障碍。灌服六味地黄丸后，大鼠悬吊时间明显延长，斜坡试验耗时明显缩短，表明六味地黄丸可明显提高脑瘫模型大鼠的肢体肌肉力量和调节机体平衡的能力，以改善其运动功能。

AchE是一种在动物体内广泛存在的水解酶，能够快速催化水解神经递质乙酰胆碱(Ach)，使神经冲动传递停止，维持突触后膜的去极性，从而使整个胆碱能神经系统的功能得到保证。AchE含量的降低短期内会导致Ach在突触中的积累，使神经元异常兴奋，机体可能表现出震颤，痉挛等症状。另有报道AchE还参与细胞的发育和成熟，促进神经元发育，修复受损的神经细胞，具有一定的神经营养因子样作用[7-9]。本实验研究结果表明，六味地黄丸能明显提高模型大鼠脑组织AchE的含量，差异有统计学意义(P<0.05)。由此推测，六味地黄丸增强脑瘫模型大鼠运动能力可能与改善胆碱能神经系统功能有关。

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2016-12-12

2017-03-30

黑龙江省博士后资助项目(LBH-Z13190);黑龙江省2015年研究生创新科研基金项目

高长玉(1971-)，男，博士，教授，硕士研究生导师，从事方剂学的教学与研究工作。现为黑龙江省小儿脑性瘫痪防治疗育中心博士后科研工作站在站博士后。

*通讯作者：姜志梅(1966-),女，教授,主任医师,硕士研究生导师,主要从事儿童康复临床、教学与研究。

R285.5;R289.54

A

1002-2392(2017)02-0080-02