番茄红素对荷卵巢癌大鼠免疫功能的影响及其机制研究

柴静波 李 萍 裴志萍

番茄红素对荷卵巢癌大鼠免疫功能的影响及其机制研究

柴静波1李 萍1裴志萍2

目的研究番茄红素(LP)改善荷卵巢癌大鼠免疫功能的作用并探讨其机制。方法 将卵巢癌细胞NUTU-19接种于腋窝皮下，制备荷卵巢癌大鼠模型，取60只模型大鼠随机分为模型组、顺铂组(2 mg/kg)和LP(40、20、10 mg/kg)组，每组12只；各治疗组均隔天腹腔注射给药一次，共5次。观察各组大鼠一般生存状态和肿瘤生长状况；称量肿瘤重量并计算抑瘤率，通过HE染色观察肿瘤组织形态结构变化；噻唑蓝(MTT)比色法测定脾淋巴细胞转化率；酶联免疫(ELISA)法测定血清中白细胞介素-2(IL-2)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量；流式细胞仪术(Flow cytometry)检测血中T淋巴细胞亚群(CD4+、CD8+)百分率并计算CD4+/CD8+。结果 与模型组比较，发现LP各组大鼠饮食状况好转，瘤体减小、活动度和硬度较差，肿瘤组织细胞皱缩、呈片状坏死等病变，上述改变以LP 40 mg/kg组最为显著；LP(40、20 mg/kg)组瘤重显著减轻且抑瘤率显著升高(P<0.05，P<0.01)，脾淋巴细胞转化率显著升高(P<0.05，P<0.01)，血清中IL-2和TNF-α含量均显著降低(P<0.05，P<0.01)，血液中CD8+百分率显著降低(P<0.05，P<0.01)，LP 40 mg/kg组CD4+百分率显著升高(P<0.05)，LP(40、20 mg/kg)组CD4+/CD8+显著升高(P<0.05，P<0.01)。结论 LP具有提高荷卵巢癌大鼠免疫功能的作用，其机制可能与LP能够有效降低炎症细胞因子(IL-2、TNF-α)含量以及提高CD4+/CD8+比值有关。

番茄红素；卵巢癌；大鼠；免疫功能；机制

妇科恶性肿瘤中卵巢癌致死率高居第一位[1]，严重威胁着女性生命健康。既往病理生理学研究发现癌症患者免疫系统处于抑制状态，免疫活性细胞和活性因子功能低下，从而导致肿瘤细胞易于生长和转移[2-3]，因此改善机体免疫功能或许是研发抗肿瘤药物的新思路。番茄红素(Lycopene，LP)是一种具有良好的抗氧化、增强机体免疫力等多种药理学作用的胡萝卜素[4-6]。本实验通过建立荷卵巢癌大鼠模型并给予LP干预治疗，以顺铂为阳性对照药物，研究LP对荷卵巢癌大鼠免疫功能的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

实验用Fischer 344大鼠(SPF级，雌性，鼠龄8周龄，体质量130～150 g)购自上海斯莱克实验动物有限责任公司；低分化人上皮性卵巢癌NUTU-19细胞株购自上海桥杜商贸有限公司细胞中心；LP购自南京泽朗生物科技有限公司(纯度≥96%，批号：20131217)；注射用顺铂购自齐鲁制药有限公司(30 mg：6 mL)；RPMI-1640培养基购自Gibco公司；白细胞介素-2(IL-2)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)试剂盒购自北京博奥生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 模型的制备与分组 参照邹党华等[7]报道的实验方法建立荷卵巢癌大鼠模型：实验用人上皮性卵巢癌NUTU-19细胞株复苏后接种于RPMI-1640培养基，取对数生长期细胞并调整细胞浓度为2×107个/mL，无菌条件下注射接种(0.2 mL)于Fischer 344大鼠右侧腋窝皮下，造模结果的判定：10天后接种位置出现约0.4 cm×0.4 cm肿瘤即认定为造模成功。取60只模型大鼠随机分为模型组、顺铂组(2 mg/kg)和LP(40、20、10 mg/kg)组，每组12只(n=12)；LP各组和顺铂组腹腔注射给药治疗，模型组腹腔注射给予等体积生理盐水，每两天一次，共5次。治疗完成后观察各组大鼠生存状态及瘤体特征。

1.2.3 肿瘤组织形态学变化的观察 处死后剥取肿瘤组织置于4%多聚甲醛溶液中进行固定，然后依次行石蜡包埋、切片、展片和脱蜡水化处理后，进行常规HE染色，然后通过倒置光学显微镜观察并照相保存。

1.2.4 脾淋巴细胞转化率的测定 麻醉后取脾脏组织，行研磨匀浆并采用200目筛过滤以制备单细胞悬液，离心弃上清，加入10 mL NH4Cl、37℃水浴10 min，PBS溶液冲洗2次，加入适量培养液制备浓度为2×106个/mL的细胞悬液，然后分别转移至96孔培养板中(每组设6个复孔，n=6)，3孔加培养液100 μL PHA液(实验孔)，3孔加100 μL培养液(对照孔)，置于培养箱中培养48 h后滴加20 μL/孔 MTT溶液(5 mg/mL)，继续培养4 h后去上清并加入200 μL二甲基亚砜(DMSO)，采用自动振荡器振荡处理10 min后采用酶标仪测定490 nm处吸光度(OD)，计算刺激指数(SI)以反映脾淋巴细胞转化率：SI计算公式为：

1.2.5 血清中炎症细胞因子水平的测定 麻醉后经腹主动脉取血并离心(1 500 rpm，10 min)后取血清，严格按照IL-2、TNF-α试剂盒操作说明进行处理，然后通过酶标仪测定各组大鼠血清中IL-2、TNF-α含量水平。

1.2.6 血液中CD4+、CD8+细胞百分率的测定及CD4+/CD8+比值的计算 麻醉后经腹主动脉取血，离心(10 000 rpm，5 min)后弃上清，PBS溶液冲洗2次，加乙醇(70%浓度，5 mL)混匀后于4℃环境放置48 h，倾去乙醇后经PBS溶液冲洗2次，加水解酶RNase 5 μL(10 mg/mL)、37℃放置1 h后加入碘化丙啶(100 μg/mL)染液，室温避光孵育30 min后通过流式细胞仪检测CD4+、CD8+百分率，根据CD4+、CD8+百分率计算CD4+/CD8+比值。

1.3 统计学方法

运用软件SPSS 17.0进行数理统计分析，计量资料多组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验；计数资料采用卡方检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠一般状况及肿瘤特征

皮下注射接种卵巢癌NUTU-19细胞3天后，荷瘤大鼠出现皮毛松散、饮食状况差，接种部位出现约0.4 cm×0.4 cm大小的肿瘤，瘤体呈现质硬、活动、与胸壁不粘连等典型特征。经LP治疗后，荷瘤大鼠皮毛松散、饮食状况差等一般生存状态明显好转；瘤体减小、活动度和硬度降低，以LP 40 mg/kg组效果最为显著。

2.2 各组大鼠荷肿瘤组织形态学变化

模型组大鼠肿瘤组织结构和细胞形态均未见异常：细胞呈椭圆形，胞质饱满，胞核呈两个或多个，核仁深染；LP(40、20、10 mg/kg)组和顺铂组肿瘤组织呈现细胞皱缩、数量减少、间隙增大、核染色质边集，出现片状坏死区，上述现象以LP 40 mg/kg组最为显著(图1)。

图1 各组大鼠肿瘤组织形态学变化(HE 400×)Figure 1 The morphological changes of tumor tissue of the rats in each group(HE 400×)

2.3 各组大鼠瘤体重量及抑瘤率

与模型组比较发现，LP(40、20 mg/kg)组和顺铂组瘤体重量显著减轻、抑瘤率显著升高(P<0.05，P<0.01)，LP(10 mg/kg)组瘤体重量无统计学差异(P>0.05)，抑瘤率存在统计学差异(P<0.01)；与顺铂组相比发现，LP(40、20、10 mg/kg)组均无统计学差异(P>0.05)(表1)。

表1 各组大鼠瘤体重量及抑瘤率Table 1 The tumor weight and inhibitory rate of in each group

Note：Compared with model group，△P<0.05，△△P<0.01.

2.4 各组大鼠脾淋巴细胞转化率

与模型组比较发现，LP(40、20 mg/kg)组大鼠脾淋巴细胞转化率显著升高(P<0.05，P<0.01)，顺铂组大鼠脾淋巴细胞转化率无统计学差异(P>0.05)；与顺铂组比较发现，LP(40 mg/kg)组脾淋巴细胞转化率显著升高(P<0.05)(表2)。

2.5 各组大鼠血清中炎症因子水平

与模型组比较发现，LP(40、20 mg/kg)组和顺铂组大鼠血清中IL-2、TNF-α含量显著降低(P<0.05，P<0.01)；与顺铂组比较，LP(40 mg/kg)组IL-2含量显著降低(P<0.05)，TNF-α含量无统计学差异(P>0.05)(表3)。

表2 各组大鼠脾淋巴细胞转化率Table 2 The spleen lymphocyte transformation rate of in each group

Note：Compared with model group，△P<0.05，△△P<0.01；Compared with cisplatin group，▲P<0.05.

表3 各组大鼠血清中炎症因子水平Table 3 The levels of inflammatory factors in rat serum in each group

Note：Compared with model group，△P<0.05，△△P<0.01；Compared with cisplatin group，▲P<0.05.

2.6 各组大鼠血液中T淋巴细胞亚群CD4+、CD8+百分率以及CD4+/CD8+比值

与模型组比较发现，LP(40 mg/kg)组和顺铂组大鼠血液中CD4+百分率显著升高(P<0.05)，LP(40、20 mg/kg)组和顺铂组CD8+百分率显著降低(P<0.05，P<0.01)、CD4+/CD8+显著升高(P<0.05，P<0.01)；与顺铂组比较发现，LP(40、20、10 mg/kg)组CD4+、CD8+百分率和CD4+/CD8+比值均无统计学差异(P>0.05)(表4)。

表4 各组大鼠血液中CD4+、CD8+百分率及CD4+/CD8+比值Table 4 The present of CD4+，CD8+ in blood and the ratio of CD4+/CD8+ in each group

Note：Compared with model group，△P<0.05，△△P<0.01.

3 讨论

妇科恶性肿瘤中卵巢癌发病率居第二位、致死率高居第一位[1]。目前，临床上对于卵巢癌的治疗主要以手术清除联合术后化疗为主，该治疗方案能够暂时清除并抑制肿瘤细胞生长，但3年内肿瘤复发率高于50%，5年生存率不足30%，因此研发能够有效抑制肿瘤生长和转移以提高肿瘤患者生存率的新型药物，仍是医药工作者亟需解决的临床难题。

LP是一种类胡萝卜素，具有增强机体免疫力等多种作用[4-6]。本实验通过建立荷卵巢癌大鼠模型并给予LP干预，以顺铂为阳性对照药物，研究发现LP能够有效改善荷卵巢癌大鼠一般生存状态、降低肿瘤组织活动度和硬度，诱导肿瘤组织细胞坏死、减轻瘤体重量、提高抑瘤率，提示LP具有抑制荷卵巢癌大鼠肿瘤组织生长的作用。

脾脏组织是机体重要的的外周免疫器官，脾淋巴细胞转化百分率是反映机体细胞免疫最基本的指标[8]。IL-2是一种细胞因子，在恶性肿瘤免疫应答反应中发挥着重要的调控作用[9]，Boyman等[10]和Gaffen等[11]研究发现IL-2具有促进肿瘤细胞免疫耐受的作用，其对免疫功能的影响与免疫细胞状态和IL-2的浓度、作用时间等因素密切相关。张建武等[12]研究发现处于肿瘤、炎症等病理状态的机体内TNF-α合成及分泌增加，而体内TNF-α过量将抑制自身机体免疫功能，Anquetil等[13]研究发现TNF-α影响免疫球蛋白IgG和lgM的生成并影响T淋巴细胞对肿瘤细胞正常的免疫反应。CD4+分子和CD8+分子为两种T淋巴细胞亚群，它们在细胞免疫应答反应中起着非常关键的作用[14]，Liu等[15]进一步研究发现CD4+/CD8+比值是反映机体免疫状态的重要指标之一，CD4+/CD8+比值越高、机体免疫功能越好。本实验研究发现，荷卵巢癌大鼠经腹腔注射给予LP治疗后，脾淋巴细胞转化率显著提高，IL-2和TNF-α含量显著降低，CD4+百分率提高、CD8+百分率降低而CD4+/CD8+比值显著提高，提示LP具有提高荷卵巢癌大鼠免疫功能的作用。

综上所述，LP具有改善荷卵巢癌大鼠免疫功能的作用，表现出对肿瘤组织生长的抑制作用；其机制可能与LP能够有效提高脾淋巴细胞转化率，降低IL-2和TNF-α含量水平，提高CD4+百分率、降低CD8+百分率，提高CD4+/CD8+比值有关。

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(收稿：2016-01-27)

The effects and mechanism of Lycopene on immune function of ovarian cancer rats

CHAIJingbo1，LIPing1，PEIZhiping2

1.Department of Obstetrics，The Second Hospital of Handan，Handan 056001，China；2.Department of General Surgery，The Second Hospital of Handan

Objective To investigate the effects of Lycopene(LP)on immune function of ovarian cancer rats′ and its mechanism.Methods Sixty ovarian cancer rat models made by injecting ovarian cancer cell line NUTU-19 were divided into five groups randomly：model group，Cisplatin group(2 mg/kg)and LP(40，20，10 mg/kg)group，n=12；the LP and Cisplatin were given by intraperitoneal injection，once every two days for 5 times.The rats general states and tumor growth conditions were observed，the tumor tissue morphological changes was observed by H&E staining；the tumor weight，inhibition rate，spleen lymphocyte transformation rate were detected；and the content of IL-2 and TNF-α in serum were detected.The present of CD4+，CD8+in blood were detected and the ratio of CD4+/CD8+was calculated.Results The food situation of the rats in LP groups was improved，tumor was reduced，activity and hardness were poorer，necrosis presented，tumor cell shrinkage and other pathological morphological changes appeared，especially the rats in LP 40 mg/kg group.Compared with model group，the tumor weight in LP(40，20 mg/kg)groups was decreased，the inhibition rate and the spleen lymphocyte transformation rate were increased；the contents of IL-2 and TNF-α were decreased；the CD8+present was decreased，while the CD4+present in LP 40 mg/kg group was increased，the ratio of CD4+/CD8+was increased.All of the difference above were significant(P<0.05，P<0.01).Conclusion LP can effectively improve the immune function of ovarian cancer rat；which perhaps relates to its effects of reducing the inflammatory cytokines levels and increasing the ratio of CD4+/CD8+.

Lycopene；Ovarian cancer；Rat；Immune function；Mechanism

1.邯郸市第二医院妇产科(邯郸 056001)；2.邯郸市第二医院外一科

柴静波，女，(1980-)，本科，主治医师，从事妇产科疾病的研究。

柴静波，E-mail：zqzhlx@126.com

R737.3

A

10.11904/j.issn.1002-3070.2017.01.003