乙肝病毒蛋白和基因在肝内和肝外胆管癌组织中的检测及意义

吴旖琦 刘 颖 赵 丽 金晓明

乙肝病毒蛋白和基因在肝内和肝外胆管癌组织中的检测及意义

吴旖琦1刘 颖2赵 丽3金晓明1

目的研究乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染与胆管癌(Cholangiocarcinoma，CC)的关系，并明确其与肝内胆管癌(Intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC)和肝外胆管癌(Extrahepatic cholangiocarcinoma，ECC)发生的关系。方法 采用免疫组化、巢式PCR对52例CC(21例肝内胆管癌和31例肝外胆管癌)石蜡包埋组织进行HBV相关蛋白及基因的检测。结果 21例ICC组织中HBsAg阳性表达率为23.8%(5/21)，HBcAg阳性表达率为19.0%(4/21)，HBV X 基因检出率为33.3%(7/21)。在31例ECC组织中均未检出HBsAg、HBcAg及HBV X基因。结论 HBV感染与ICC发生关系密切，但可能非ECC发生的危险因素。HBV X基因的整合可能参与肝内胆管上皮细胞的癌变过程。

胆管癌；乙型肝炎病毒；肝内胆管癌；肝外胆管癌

胆管癌(Cholangiocarcinoma，CC)是起源于胆管上皮细胞的恶性肿瘤，根据其在肝内发生的部位不同可以分为肝内胆管癌(Intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC)和肝外胆管癌(Extrahepatic cholangiocarcinoma，ECC)[1]。ICC和ECC在流行病学、临床表现及治疗等方面均存在差异[2-3]。既往研究认为CC的发生与原发性硬化性胆管炎、肝吸虫病、肝内胆管结石等相关[4-5]。最近国内外相继有报道指出乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染也是ICC发生的危险因素[6-8]，但其是否与ECC发生相关的研究却很少。我国是HBV感染的高发区，HBV作为肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)发生的危险因素已得到广泛认可。然而，HBV感染是否与ICC、ECC发生相关，其可能的机制如何，尚未得到深入研究。本研究通过检测肝内外胆管癌组织中HBV蛋白及基因，明确HBV感染与ICC和ECC发生的关系以及作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 组织标本 52例CC(21例ICC和31例ECC)组织标本，为哈尔滨医科大学附属第二医院、哈尔滨医科大学附属第三医院及黑龙江省医院2002—2008年间行手术切除的标本。临床资料显示52例CC患者中，男性31例，女性21例，平均年龄57.59岁。血清HBsAg阳性者16例(ICC为11例，占68.8%；ECC为5例，占31.3%，其中1例伴HBV和HCV的混合感染)，HBsAg阴性者36例。全部标本均经病理检查证实。肿瘤位置：肝内21例(5例为HCC和ICC的混合型)，肝外31例；随机选取同期住院的非肝病患者49例作为对照组进行临床资料分析。

1.1.2 主要实验试剂 鼠抗HBsAg单克隆抗体、兔抗HBcAg多克隆抗体及S-P免疫组化二抗试剂盒均购自北京中杉生物技术有限公司；PCR扩增试剂盒购自TAKARA公司；PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 HBsAg及HBcAg蛋白的检测 52例CC标本常规切成4～5 μm厚石蜡切片，采用免疫组织化学SP法检测HBsAg及HBcAg蛋白的表达，检测方法按试剂盒说明操作，石蜡切片常规脱蜡至水，滴加内源性过氧化物酶阻断剂，微波抗原修复；山羊血清封闭后，滴加一抗(HBsAg 1∶100稀释，HBcAg 1∶50稀释)4℃ 16 h；滴加二抗室温30 min后，滴加过氧化物酶，37℃孵育15 min，DAB显色，苏木素复染，脱水，透明，封固。

免疫组化检测结果判定：阳性表达位于细胞核或/和细胞浆呈棕黄色颗粒状。无棕黄色颗粒为阴性。

1.2.2 石蜡包埋组织HBV DNA 提取 52例CC组织无菌操作常规切片，切取10 μm厚切片，每2～4片放入一个1.5 mL灭菌EP管中。使用TAKARA公司DNA提取试剂盒，方法参照操作说明进行。滴加0.57 mL DEXPAT到装有石蜡包埋组织的EP管，100℃加热处理10 min。加热后立即12 000 r/min，4℃离心10 min。移液器吸取水层。吸取的水层直接作为PCR反应模板。

1.2.3 巢式PCR扩增HBV X基因 HBV X基因PCR引物：外套上游引物W1：5′-TGCCAACTGGATCCT TCGCGGGACGTCCTT-3′；外套下游引物W2：5′-GTTCACGGTGGT CTCCATG-3′；内套上游引物N1：5′-GTCCCCTTCTTCATCTGCCGT-3′；内套下游引物N2：5′-ACGTGCAGAGGTGAAGCGAAG-3′。预计内套引物扩增片段为233 bp。引物由上海生工公司合成。第一轮PCR反应体系：去离子水34.75 μL、PCR反应缓冲液5 μL、dNTPs 4 μL、DNA模板5 μL、外引物各1 μL、TaqDNA聚合酶0.25 μL。反应条件：95℃预变性5 min，94℃变性20 s，59℃退火30 s，72℃延伸25 s，进行35个循环，72℃延伸10 min。取第一轮产物2 μL作模板，用内套引物进行第二轮扩增，反应条件：95℃预变性5 min，94℃变性20 s，58℃退火30 s、72℃延伸25 s，进行35个循环，72℃延伸10 min。2%琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增结果。预计内套引物扩增片段为117 bp。PCR对照组：阳性对照选取已证实的HBV X基因为阳性的肝炎组织。选取血清HBV标志物检测结果均为阴性的11例肝脏组织作为阴性对照。

1.2.4 统计学方法 采用SPSS 15.0统计软件进行数据分析，所有数据都是以率(%)的方式表示。两组间的比较采用卡方检验或Fisher精确检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CC组与对照组的临床资料和危险因素分析

52例CC组和49例对照组的临床资料分析结果显示，CC组HBsAg血清学阳性病例为16例(30.8%)，对照组为2例(4.1%)，CC组高于对照组，两组间差异具有统计学意义(P<0.01)(表1)。两组间在年龄、性别、病史(肝硬化、肝吸虫及慢性胆囊炎)方面差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 CC组织中HBsAg、HBcAg的免疫组化检测

免疫组化结果显示，52例CC中，有5例ICC组织HBsAg阳性表达，其中4例同时伴有HBcAg阳性表达。HBsAg阳性表达位于胞浆，呈棕黄色颗粒。HBcAg阳性表达主要位于胞核，胞浆仅有少量表达(图1)。

2.3 CC组织中HBV X基因的检测

巢式PCR检测结果显示，52例CC组织中HBV X基因检出率为13.5%(7/52)，且均为ICC。X基因第一轮扩增产物为233 bp；第二轮扩增产物在117 bp处可见阳性条带(图2)。31例肝外胆管癌及11例阴性对照肝组织均未检出HBV X 基因。

表1 CC组与对照组临床资料和危险因素的比较Table 1 Comparison of the clinical data and risk factors between CC and control cases

图1 免疫组织化学检测CC组织中HBsAg、HBcAg表达Figure 1 Immunohistochemistry assay for HBs antigens，HBc antigens in CC tissues

图2 巢式PCR检测胆管癌组织中HBV X基因Figure 2 Nested-PCR detected HBV X gene in CC tissues

2.4 ICC与ECC临床资料及HBV X基因和蛋白检测结果的比较

21例ICC中，血清学和组织中HBsAg检测阳性分别为11例和5例，HBV X基因检测阳性为7例；31例ECC中，HBsAg血清学阳性有5例，组织中HBV蛋白和基因的检测均为阴性，两组间比较差异有统计学意义(P<0.01)(表2)。ICC组和ECC组在性别、年龄和病史(肝吸虫病史，慢性胆囊炎病史、肝硬化)方面比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 肝内胆管癌和肝外胆管癌HBV感染和危险因素的比较Table 2 Comparison of HBV infection and risk factors between ICC and ECC

3 讨论

目前研究认为，CC的发生与原发性硬化性胆管炎、慢性胆石病、肝吸虫病密切相关，但是，大部分CC的发生却缺乏上述危险因素[9-10]。近年来，国内外相继有研究表明，HBV和丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)的感染也与CC的发生关系密切[11-14]。日本的一项研究显示，600名HCV相关性肝硬化患者中，有2.3%的人可在7年后发展为胆管癌[15]。意大利Donato等的研究显示，HCV感染为ICC发生的危险因素，而HBV感染与ICC发生无相关性[16]。而美国的一项Meta分析结果表明，HBV感染是ICC发生的独立危险因素[17]。Peng等中国学者的研究认为HBV与ICC的发生密切相关[18]。在本研究中，52例CC患者中血清学HBsAg阳性有16例(30.8%)，而HCV阳性仅有1例(1.5%)，且同时合并HBV感染，提示HBV而非HCV与CC的发生密切相关。我国是HBV的高流行地域，而HCV的流行率则相对较低。因此，造成上述研究结果的不一致可能与不同国家肝炎病毒流行类型的差异有关。

为了进一步证实HBV的感染是否与ICC和ECC的发生都有关系，我们分别对21例ICC和31例ECC组织采用免疫组化和巢式PCR方法进行HBV蛋白及X基因的检测。免疫组化检测结果发现，21例ICC组织中有4例HBsAg、HBcAg蛋白均为阳性表达，1例仅HBsAg蛋白表达阳性；然而在31例ECC组织中则无此两种蛋白的表达。基因检测结果显示，21例ICC有7例检出HBV X 基因，而31例ECC组织未检出X基因。上述结果证实，ICC组织中确实有HBV蛋白及基因的表达，这与Perumal等一些学者的研究结果一致[19-20]。而在ECC组织中既无HBV蛋白又无X基因的表达，这说明HBV感染可能是ICC发生的危险因素。由于胆管上皮细胞与肝细胞在胚胎发生上有同源性[21]，肝内胆管癌细胞无论从形态学以及免疫组化特征上均与肝干细胞相类似[22]。因此现在普遍认为HBV与ICC的发生可能与其致肝细胞癌的机制相似。本研究中，在ICC组织中检测到HBV蛋白和X基因的表达，表明持续的HBV感染引起胆管上皮炎症过程可能最终导致ICC的发生。此外，HBV X蛋白在体内外都可抑制p53 基因介导的细胞凋亡，它还可使原癌基因激活[23]；HBV X基因还可通过顺式激活hTERT 的mRNA引起胆道上皮细胞的增殖、分化和癌变[24]。上述机制可能都在HBV感染导致ICC发生过程中发挥作用。

本研究中，有6例血清学阳性胆CC组织中未检测到HBV蛋白，4例未检测出HBV X基因，这种HBV表达在血清学和组织中检测结果不一致的原因一方面可能由于HBV蛋白和基因在肝内分布较局限，而手术切除标本有限，未能取到具有代表性的组织；另一方面可能因为肝脏体积较大，即使每个肝细胞分泌极少量病毒颗粒也能引起持续的毒血症，但是组织中HBV蛋白的表达量很少，因而出现血清学HBV蛋白检测结果阳性而组织中蛋白表达为阴性。此外，7例HBV DNA阳性ICC中有2例血清学HBsAg检测为阴性，这部分患者可能为HBV隐匿性感染，即HBsAg的检测为阴性，但肝脏组织中HBV DNA阳性的个体[25]。上述HBV表达在血清学和组织中检测结果不一致的具体机制仍需进一步研究证实。

通过对HBV DNA阳性ICC患者临床资料进行分析发现，7例ICC患者除2例有肝硬化病史，1例有吸烟饮酒史及1例有肝吸虫病史外，其余3例均无其他疾病史，进一步说明HBV感染可能是ICC发生的独立危险因素。

综上所述，本研究发现HBV感染与ICC的发生密切相关，而与ECC无相关性，HBV感染可能是ICC发生的独立危险因素。但是，由于本研究样本数量有限，HBV感染与ICC发生的关系仍有待更进一步研究证实。面对CC的高死亡率，需要更深入的研究HBV感染在ICC发生发展过程中的作用。也许有效控制HBV感染能从根本上预防CC的发生。

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(收稿：2016-09-19)

Detection of hepatitis B virus protein and gene in intrahepatic and extrahepatic cholangiocarcinoma tissue

WUYiqi1，LUIYing2，ZHAOLi3，JINXiaoming1

1.Department of Pathology，Basic Medical Science College，Harbin Medical University，Harbin 150081，China；2.Department of Burn，Heilongjiang Province Hospital；3.Intensive Medicine，Harbin Children′s Hospital

Objective To investigate the importance of hepatitis B virus(HBV)infection in the pathogenesis of cholangiocarcinoma(CC)and further clarify the correlation between the occurrence of intrahepatic and extrahepatic cholangiocarcinoma.Methods HBV protein and gene of 52 formalin fixed，paraffin embedded tissues with CC were detected by immunohistochemistry and nest PCR.Results Hepatitis B virus X gene was detectable in 33.3%(7/21)of 21 intrahepatic cholangiocarcinoma cases.Hepatitis B surface antigen(HBsAg)was detectable in 21.7%(5/21)and hepatitis B core antigen(HBcAg)was detectable in 19.0%(4/21)of 21 intrahepatic cholangiocarcinoma cases.In contrast，no HBsAg，HBcAg and hepatitis B virus X gene were detected in any of the 31 extrahepatic cholangiocarcinoma cases.Conclusion HBV infection is a significant risk factor for intrahepatic cholangiocarcinoma，but not for extrahepatic cholangiocarcinoma，in Northeast of China.The integration of HBV gene may be involved in the carcinogenesis of intrahepatic bile duct epithelial cells.

Cholangiocarcinoma；Hepatitis B virus；Intrahepatic cholangiocarcinoma；Extrahepatic cholangiocarcinoma

黑龙江省教育厅科学技术研究面上项目(12541361)

1.哈尔滨医科大学基础医学院病理教研室(哈尔滨 150081)；2.黑龙江省医院烧伤科；3.哈尔滨市儿童医院重症医学科

吴旖琦，女，(1977-)，博士，副教授，从事消化系统肿瘤的研究。

金晓明，E-mail：jinxm55@163.com

R730.43

A

10.11904/j.issn.1002-3070.2017.01.002