小细胞性肺癌患者检测抗纺锤体抗体和抗着丝点抗体的临床意义①

谭立明 张玉红 陈娟娟 李 华 肖扬婧卿 吴 洋 曾婷婷 田永建 余建林

(南昌大学第二附属医院检验科，南昌330006)

小细胞性肺癌患者检测抗纺锤体抗体和抗着丝点抗体的临床意义①

谭立明 张玉红②陈娟娟 李 华 肖扬婧卿②吴 洋 曾婷婷 田永建 余建林

(南昌大学第二附属医院检验科，南昌330006)

目的：研究抗纺锤体(MSA)和抗着丝点(ACA)抗体检测对诊断小细胞性肺癌(SCLC)的临床价值，为SCLC的分子研究提供临床依据。方法：对93例SCLC患者和208例非小细胞性肺癌(NO-SCLC)患者及50例健康体检者，用酶联免疫法定量检测MSA抗体，间接免疫荧光法定性检测MSA、ACA和抗核抗体(ANA)，并对其结果进行回顾性分析。结果：①IIF法检测SCLC组MSA和ACA阳性率为36.56%和30.11%，均高于其他肿瘤组(P<0.01)。②相关性分析，MSA与SCLC的RR值高达12.93、12.74，ACA和ANA与SCLC的RR值为4.31和3.48。③MSA检测SCLC的ROC曲线下面积AUC为0.778，诊断价值中等。 结论：MSA和ACA对SCLC有很强正相关危险因素，可能参与SCLC的发生发展，对SCLC的早期检测、临床诊断及潜在的治疗方法有一定的应用价值。

小细胞型肺癌；抗纺锤体抗体；抗着丝点抗体；抗核抗体

小细胞型肺癌(Small cell lung cancer，SCLC)是我国乃至全球癌症死亡的主要原因，占肺癌的10%～15%[1]。SCLC分化极差、侵袭性强、生长迅速，常发展到晚期才出现临床表现，早诊断、早治疗是关键。目前的诊断方法有病理学、影像学、血清学等检测方法，对SCLC诊断率均不高、特异性不强[2]，SCLC有一特点——早期就发生血行转移，理论上利用肿瘤自身抗体检测肿瘤的特异性和敏感性均比利用肿瘤抗原检测肿瘤要高[3]，通过肿瘤自身抗体检测对提高SCLC的诊断率、生存率意义更大。笔者在临床检测中发现，在SCLC患者血清中MSA和ACA阳性率明显高于其他肿瘤患者，现将研究结果分析报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料来源 肿瘤患者均为2011年12月～2013年12月在南昌大学第二附属医院门诊及住院确诊病例，SCLC患者93例(男69例、女24例，30～82岁，平均62岁)，肺腺癌(Lung adenocarcinoma carcinoma，LAC)62例(男48例、女14例，42～77岁，平均64岁)，肺鳞癌(Lung squamous carcinoma，LSC)52例(男39例、女13例，40～81岁，平均65岁)，胃癌(Gastric cancer，GC)27例(男18例、女9例，45～71岁，平均56岁)，肝癌(Hepatocellular carcinoma，HC)29例(男20例、女9例，39～75岁，平均59岁)，大肠癌(Intestinal cancer，IC)22例(男14例、女8例，44～69岁，平均58岁)，鼻咽癌(Nasopharynx cancer，NC)16例(男11例、女5例，39～71岁，平均57岁)；健康对照50例均来自南昌大学第二附属医院体检中心健康体检者(男31例、女19例，27～65岁，平均55岁)。所有入选者自愿接受实验并签署知情同意书。

1.1.2 诊断依据 SCLC诊断标准参考美国NCCN小细胞肺癌临床实践指南[4]。

1.1.3 纳入标准 符合所有条件者予以纳入：①知情、自愿参与；②诊断明确，临床、影像学、病理组织学资料完整；③对入选患者的资料重新评估，否定合并其他自身免疫性疾病及合并其他癌症；④健康对照组者血常规、血压、血糖、血脂、胸片、心电图及肝胆胰检查无异常。

1.1.4 排除标准 以下情况者予以剔除：①肿瘤分型不明确或非原发性肿瘤；②合并严重心、肺、肝、肾脏等系统疾病，甲状腺疾病、糖尿病；③妊娠或哺乳期妇女；④不符合纳入标准者。

1.2 方法

1.2.1 标本的采集 空腹采静脉不抗凝血3.0 ml左右，2 500 r/min离心15 min分离血清，-20℃冷冻待检，避免反复冻融。

1.2.2 间接免疫荧光法 检测MSA、ACA和ANA抗体。试剂由德国欧蒙公司生产，MSA抗体采用欧蒙实验室提供的全新Hep-20-10细胞株，ACA和ANA采用Hep-2细胞，4℃保存备用。标本按试剂要求稀释，取25 μl于玻片上，覆上生物膜片，室温孵育30 min，洗去游离标本，用洗液浸泡5 min，沥干加20 μl异硫氰酸荧光素标记二抗，避光室温孵育30 min，冲去游离二抗，用洗液浸泡5 min，沥干后用甘油封片。荧光显微镜观察结果。

1.2.3 ELISA法 检测MSA抗体。试剂盒由美国R&D公司生产，操作步骤严格按照试剂盒操作说明进行，在包被纺锤体抗原的聚丙乙烯孔中，样本孔加入稀释液40 μl、血清10 μl，标准孔加入不同稀释浓度标准品50 μl，空白孔不加样本和酶，37℃温箱孵育30 min，洗液洗板5次，加辣根过氧化物酶(HRP)结合的纺锤体抗原50 μl，37℃温箱孵育30 min，洗板5次，加底物和显色剂显色各50 μl，37℃温箱孵育10 min，加终止液，用450nm波长比色，计算结果。

1.2.4 评价指标 根据经金标准确诊的患者体内抗体检测结果来计算自身抗体的临床评价指标：敏感性、特异性、阳性似然比、阴性似然比、准确性和约登指数。

1.3 统计学分析 统计分析应用SPSS16.0软件，计数资料以例数(百分比)描述。①组间单因素分析采用χ2检验。②MSA与SCLC相关性用相对危险度(Relative risk,RR)及RR的显著性χ2确定，RR>1,正关联危险因素；RR<1,保护因素。③抗体间优势分析采用配对χ2检验，一致性分析计算Kappa值(P<0.01)。④对定量资料作受试者特征曲线(Receiver operating characteristic,ROC),计算ROC曲线下面积(Area under the curve,AUC)。

2 结果

2.1 MSA、ACA、ANA与SCLC相关性分析 SCLC患者血清MSA、ACA抗体检测阳性率与其他癌症患者比较，经χ2检测，均P<0.01，差异有非常显著统计学意义；相关性分析RR值显示MSA为SCLC关联很强的正相关危险因素，ACA、ANA为关联强的正相关危险因素，结果见表1。

2.2 SCLC与其他肿瘤组检测自身抗体结果(间接免疫荧光法) SCLC组MSA、ACA和ANA阳性率为36.56%、30.11%和24.73%，MSA和ACA与其他组比较差异均有统计学意义，χ2检测，均P<0.01，结果见表2。

表1 两种检测方法对SCLC及其他癌症患者血清MSA抗体检测结果[n(%)]

Tab.1 MSA detection in patients with SCLC and other types of cancer by two methods[n(%)]

GroupsnELISAMSAMSAIIFACAANASCLC9339(41.94)34(36.56)28(30.11)23(24.73)NO-SCLC20811(5.29)9(4.33)7(3.37)19(9.13)RR12.9312.744.313.48χ262.3154.5311.3814.58P<0.01<0.01<0.01<0.01

Note：RR value:Highly strongly relative (≥10.0),strongly relative(3.0-9.0),intermediately relative (1.5-2.9).

表2 SCLC及其他癌症患者自身抗体检测结果[n(%)]

Tab.2 Results of autoantibodies in SCLC and other cancer groups[n(%)]

Note：vs SCLC,1)P<0.01;2)P<0.05.

表3 SCLC中各项临床评价指标结果

Tab.3 Clinical evaluation parameters in SCLC

GroupSensib-ility(%)Specif-icity(%)Likelihoodratio(+)Likelihoodratio(-)Availab-ility(%)YoudenindexMSA36.5695.197.600.6777.080.32ACA30.1196.638.930.7276.080.27ANA24.7389.902.450.8469.770.15

表4 SCLC组抗体间优势分析(P)和一致性分析Kappa (κ)

Tab.4 Advantage analysis(P) and consistency analysis [Kappa(κ)] between antibodies in SCLC group

GroupMSA&ACAMSA&ANAACA&ANAP0.3270.0520.383K(P<0.01)0.3740.3280.435

Note：Kappa(κ):0.4-0.6 as moderate consistency,0.6-0.8 as high consistency,>0.8 as great consistency.

2.3 SCLC患者MSA、ACA和ANA抗体检测的各项临床评价指标(免疫荧光法) MSA对检测SCLC的准确性最高为77.6%，MSA和ACA特异性高达95.19%和96.63%，结果见表3。

2.4 SCLC患者MSA、ACA和ANA抗体间优势分析(P)和一致性分析Kappa (κ)(免疫荧光法) 一致性分析显示在SCLC中MSA与ACA、ANA一致性较差；优势分析显示三者对诊断SCLC均无明显差异。见表4。

2.5 MSA对诊断SCLC准确性评估作ROC曲线 MSA的 AUC(P<0.01)为0.778，诊断价值中等。见图1。

3 讨论

SCLC 目前缺乏有效的早期诊断及治疗方法，治疗后复发率高，5年生存率仅为6.4%[2]。SCLC是来自肺神经内分泌细胞、恶性程度最高的一种肺癌，一些罕见的属于自身免疫性疾病的神经系统副肿瘤综合征与SCLC高度相关。研究表明，在一些没有自身免疫性疾病的早期SCLC患者或在未来发展为SCLC患者体内可发现多种自身抗体[5,6]，虽然滴度不高，但这足以说明自身免疫反应影响着SCLC的发生发展，这些免疫反应可能是SCLC的一个窗口期反应，在机体发展为SCLC之前免疫系统就表现出症状，这提示可以通过检测这些自身免疫性标志物(Marker)来为SCLC的早期诊断及预测提供途径。如果在未发展为SCLC时就加以干涉，或早期发现SCLC并加以正确治疗，将有希望增高SCLC的诊断率和生存率，并为改进SCLC的临床治疗方法提供方向。

导致肺癌的主要危险因素是吸烟、工作环境及遗传，研究表明肺部有害物质的长期接触可诱导细胞DNA损伤和破坏纺锤体，危险因素暴露的细胞停留在细胞分裂中期，在此过程中可产生两个以上子细胞或发生细胞融合——非整倍体细胞生成，这与中心体数目异常有关[7，8]。中心体是微管的主要组织中心，它分裂分离成纺锤体的两极，中心体数目受纺锤体功能的调控，细胞分裂中期，所有染色体的着丝点位于赤道面上，染色体分离就依靠附着于着丝点上的纺锤体微管完成[9]。研究发现在肿瘤细胞中纺锤体相关蛋白基因出现异常可表现为纺锤体相关蛋白过度表达[10]，过度表达的相关蛋白在细胞内积聚，机体免疫耐受增高引起自身免疫反应，产生自身抗体，这似乎与本研究发现的结果有奇妙的联系，IIF法检测SCLC组MSA和ACA阳性率为36.56%和30.11%，均高于其他肿瘤组，经χ2检测，均P<0.01，差异有非常显著性统计学意义。这说明免疫系统针对纺锤体及着丝点为抗原所引发的免疫反应在一定程度上影响着SCLC的发生发展过程，此结论有理可据，笔者将实验结果作相关性分析发现，两法检测MSA与SCLC的RR值分别高达12.93和12.74，ACA和ANA与SCLC的RR值为4.31和3.48，MSA为SCLC关联很强的正相关危险因素，ACA、ANA为关联强的正相关危险因素，对SCLC的早期诊断有临床应用价值。

目前，关于肿瘤的自身免疫反应的研究尚不成熟，SCLC体内能检测到多种自身抗体，但抗纺锤体抗体的研究未见报道，本研究选择Hep-20-10细胞基质检测MSA抗体，采用IIF法检测发现，Hep-20-10细胞株具有多于Hep-2数十倍的分裂期细胞。与常规方法相比，利用HEp-20-10细胞更容易辨别分裂期细胞特异性结构(着丝点、纺锤体纤维、中间体、中心粒和核仁形成区)抗体。MSA对诊断SCLC的特异性为95.19%，准确性高达77.08%，阳性率为36.56%明显高于其他肿瘤组，经χ2检测，均P<0.01，有非常显著性统计学意义；采用ELISA法定量检测MSA，并做MSA诊断SCLC的ROC曲线，ACU为0.778，诊断价值中等，当然任何一种肿瘤并不简单，几乎都不能用单一某种标志物做出诊断。染色体分裂靠纺锤丝牵拉着丝点，本研究发现抗着丝点抗体ACA对诊断SCLC的特异性高达96.63%，准确性为76.08%，SCLC组ACA阳性率为30.11%，与肺腺癌、肺鳞癌等其他癌症相比，经χ2检测，均P<0.01，差异有非常显著性统计学意义。说明细胞受纺锤体及着丝点等影响而导致分裂异常可能是SCLC的发病机制之一，然而具体的抗原蛋白定位有待进一步研究，有希望在早期甚至预测为SCLC时就采取措施，阻断其发展通路，提高诊断率和降低死亡率。

MSA、ACA阳性率在SCLC中较其他肿瘤优势明显，细胞分裂时纺锤体的纺锤丝与着丝点相连接，牵拉着丝点使姐妹染色体分离，本研究一致性分析显示在SCLC中MSA与ACA一致性较差，这说明在SCLC中MSA及ACA并非简单地以纺锤体及着丝点为抗原而产生的自身抗体。自身免疫反应产生是由于免疫系统不能识别自身抗原，肿瘤细胞自身异常可产生抗原，但许多抗原并非肿瘤细胞所特有，还有一种是机体肿瘤发生发展的过程中相关蛋白异常而产生的抗原。纺锤体及着丝点调控细胞分裂机制复杂，导致分裂异常的抗原蛋白可能有多种，途径也多样，MSA和ACA抗体的产生机制尚待进一步研究，这对研究SCLC的治疗方法也存在一定价值。ANA的靶抗原包括细胞核和细胞浆等整个细胞，ANA阳性可出现在许多疾病中，特异性较差，不能确定任何疾病，在本研究中发现SCLC组ANA阳性率为24.73%，与肺腺癌、肺鳞癌相比，经χ2检测，均P<0.05，差异均有显著性统计学意义，虽相比其他癌症并无明显优势，但对肺癌鉴别还是存在一定的价值。

综上所述，MSA和ACA是SCLC很强的正相关危险因素，可能参与SCLC的发生发展，对SCLC的早期检测、临床诊断及潜在的治疗应用存有一定价值。

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[收稿2016-06-14]

(编辑 倪 鹏)

Clinical significance of anti-mitotic spindle apparatus antibody (MSA) and anti-centromere antibody detected in patients with small cell lung cancer (SCLC)

TANLi-Ming,ZHANGYu-Hong,CHENJuan-Juan，LIHua，XIAOYang-Jing-Qing，WUYang，ZENGTing-Ting，TIANYong-Jian，YUJian-Lin.

DepartmentofClinicalLaboratory,SecondAffiliatedHospital,NanchangUniversity,Nanchang330006,China

Objective:To detect anti-mitotic spindle apparatus antibody (MSA) and anti-centromere antibody (ACA) and explore the clinical value for the diagnosis of small cell lung cancer (SCLC),providing clinical evidence for molecular studies of SCLC.Methods: 93 SCLC patients,208 non-small cell lung cancer (non-SCLC) patients and 50 healthy controls were enrolled in this study.MSA antibodies were detected by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA).MSA,ACA and anti nuclear antibodies (ANA) were examined by indirect immuno-fluorescence (IIF).And the results were retrospectively analyzed.Results: ① The positivity for MSA and ACA by IIF assay was respectively 36.56% and 30.11% in SCLC group,higher than other tumor groups (P<0.01).② In correlative analysis,the RR value between MSA and SCLC was as high as 12.93,12.74,and the RR value of ACA and ANA with SCLC was respectively 4.31 and 3.48.③the area under ROC (Receiver operating characteristic) curve (AUC) of MSA detection for SCLC was 0.778,with medium diagnostic value.Conclusion: MSA and ACA for SCLC are highly strong positive correlation risk factors,and may participate in the occurrence and development of SCLC,moreover,have some application value for early detection,clinical diagnosis and potential treatments of SCLC.

Small cell lung cancer;Human mitotic spindle apparatus antibodies;Anti-centromere antibodies;Antinuclear antibodies

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.03.021

谭立明(1963年-)，男，教授，主任技师，硕士生导师，主要从事自身免疫病的病因及抗体检测等相关性研究，E-mail：yuuje@126.com。

R734.2

A

1000-484X(2017)03-0418-04

①本文为江西省科技厅社发项目(No.2015BBG70154)、江西省科技厅重点科技成果转移转化计划(No.20151BBI90047)和江西省卫生厅科研计划支持项目(No.20133075、20151072)。

②南昌大学医学院，南昌330006。