Aurora激酶A调控卵母细胞减数分裂的分子机制

刘 凤，姚 波，莫晓龙，柳琼友，任艳萍

遵义医科大学基础医学院组织胚胎学教研室，贵州遵义 563000

Aurora激酶(aurora kinase，AURK)是广泛分布在真核生物体内、进化高度保守的丝氨酸/苏氨酸激酶家族，包括AURKA、AURKB和AURKC 3种亚型，其中，AURKA参与有丝分裂进入、中心体成熟和分离、双极纺锤体组装和稳定、染色体的浓集和中板的聚合以及染色体的正确分离[1- 2]。有文献指出，AURKA在减数分裂过程中发挥的作用与有丝分裂类似[3]，但其具体作用机制以及其与有丝分裂的异同尚不清楚。因此本文将从AURKA在卵母细胞减数分裂中定位与活化，及其在调控纺锤体形成、纺锤体组装检查点(spindle assembly checkpoint，SAC)活化以及动粒-微管附着纠错这几个方面，探讨AURKA在卵母细胞纺锤体组装和染色体分离中的作用机制。

AURKA在有丝分裂和卵母细胞减数分裂中定位的异同

在体细胞中，AURKA的信使RNA及蛋白水平在G1期最低，S期逐渐升高，G2/M期增至最高，M期结束后迅速下降，表明其表达呈现周期依赖性[4- 5]。在有丝分裂过程中，AURKA于S晚期定位于复制的中心体，阻止中心体的再次复制，促进中心体的成熟与分离；G2期随着复制的中心体移向细胞两极；有丝分裂前期，随着核膜破裂，AURKA在中心体及其附近微管上快速增加并调控纺锤体的形成和染色体分离；直到后期，随着染色体分离，AURKA定位在纺锤体两极，也定位在纺锤体中间区域，参与中央纺锤体的组装[6]；有丝分裂结束并退出时，AURKA分布于子细胞核附近[7]。

研究发现，AURKA蛋白在小鼠卵母细胞中高表达，其表达量在生发泡(germinal vesicle，GV)期和第2次减数分裂中期(MⅡ期)卵母细胞中较高，在其他减数分裂成熟阶段保持稳定[8]。在卵母细胞成熟过程中，AURKA在不同阶段的定位不同。GV期，AURKA主要富集在染色体周围，均匀分布在生发泡中[9]；生发泡破裂(germinal vesicle breakdown，GVBD)期，AURKA凝聚在染色质周围；第1次减数分裂前中期(pre-MI)和第1次减数分裂中期(MI期)，AURKA定位于纺锤体两极，调控纺锤体微管动力学和染色体排列[10]；从第1次减数分裂后期(AI期)到第1次减数分裂末期(Tel I期)，AURKA随着姐妹染色单体分离而逐渐向两极移动；到MII期，AURKA则在排出的第一极体及卵母细胞纺锤体上均有富集[11]。

由上可知，在有丝分裂和卵母细胞减数分裂早期和中期，AURKA均在纺锤体两极有定位，表明在上述时期，AURKA在卵母细胞纺锤体两极处可能发挥与有丝分裂纺锤体两极处类似的功能。然而在卵母细胞的两次减数分裂后期，AURKA仍仅定位于纺锤体两极，这与在有丝分裂后期，AURKA定位于纺锤体两极以及赤道板中间区域有所不同。该现象预示着AURKA在有丝分裂和减数分裂后期中的功能可能有所差别。

AURKA的活化

有丝分裂纺锤体组装很大程度上依赖中心体，在核膜破裂时，中心体生成的微管被姐妹染色体的动粒捕捉，形成双极纺锤体。AURKA调控纺锤体的组装已在果蝇[12]、线虫[13]和非洲爪蟾卵提取物[14]中得到证实。研究已经证明，AURKA通过作用于Ran GTPase信号通路的下游，参与有丝分裂中的纺锤体组装[14- 15]。Ran GTPase通过从importion α/β中释放爪蟾类驱动蛋白靶向蛋白2(targeting protein for Xenopus kinesin-like protein 2，TPX2)，与AURKA结合，致使AURKA发生自身磷酸化，进而被激活[16]。TPX2 RNAi介导的AURKA失活可破坏有丝分裂双极纺锤体的组装[17]。因此，Ran GTPase介导的TPX2激活AURKA对于有丝分裂纺锤体形成至关重要。

在卵母细胞中，纺锤体形成依赖于微管组织中心的自我组装。GVBD期，微管组织中心(microtubule organizing centres，MTOCs)中Ran GTPase大量增加，与有丝分裂相同，卵母细胞中Ran GTPase同样具有释放TPX2的功能[18]。敲除TPX2会导致AURKA在纺锤体极处的定位信号消失，纺锤体形态出现异常，如无纺锤体、单极纺锤体、纺锤体过度拉长或纺锤体组装异常等等[19- 20]。在小鼠[21]和线虫[13]卵母细胞中，通过抑制AURKA活性导致纺锤体形态出现同样异常表型。以上实验结果表明，在卵母细胞减数分裂中，Ran GTPase同样通过介导TPX2的释放，激活MTOCs上AURKA激酶活性，以此调控纺锤体的装配[22]。

除了TPX2之外，Bora也可以激活AURKA。在有丝分裂中，AURKA可与Bora相互作用，而发生磷酸化，激活AURKA活性[23]。Hutterer等[24]研究发现，Bora突变可导致AURKA活性减弱，且Bora可激活被蛋白磷酸酶1失活的AURKA。过量表达Bora可以挽救突变造成的AURKA活性下降、染色体定位缺陷和中心体成熟缺陷，但若AURKA突变导致其活性完全丧失，则不能被过量表达的Bora挽救突变造成的后果。以上结果表明，在有丝分裂中Bora是AURKA的激活剂。在卵母细胞中，抗体抑制Bora可导致AURKA在纺锤体的定位消失，纺锤体形成缺陷和染色体排列不齐，致使卵母细胞停滞在pre-MI/MI期[25]。Bora的基因敲除引起的AURKA活性减弱，致使有丝分裂中期停滞延长，同源染色体分离推迟[26]。因此，在卵母细胞减数分裂过程中Bora也是AURKA活化所需的。

因此，在卵母细胞中，Ran GTPase通过释放TPX2介导AURKA的活化；此外，AURKA活化也需要Bora。这与体细胞有丝分裂中AURKA活化的分子机制基本相同。

AURKA调控纺锤体组装

在体细胞中，纺锤体组装很大程度上依赖于中心体成核，在中心体具备成核能力前，需要经历一个成熟阶段。在这一成熟过程中，AURKA通过招募大量γ-微管环形复合物(γ-tubulin ring complex，γ-TuRC)和中心粒周围物质(pericentriolar material，PCM)到中心体上，促使中心体成熟与分离[27]。抑制AURKA导致中心体成熟与分离缺陷，形成单极纺锤体[28]。AURKA的具体调控机制为：AURKA通过招募一个高度保守的转化型酸性螺旋卷曲蛋白家族(transforming acidic coiled-coil proteins，TACC)到中心体，TACC与高度保守的微管聚合酶XMAP215(ch-TOG/XMAP215)的蛋白家族成员相互作用，将ch-TOG/XMAP215装载到纺锤体微管，以此对抗有丝分裂着丝粒相关驱动蛋白(mitotic centromere-associated kinesin,MCAK)和非洲瓜蟾驱动蛋白突变调节剂- 1(xenopus kinesin catastrophe modulator- 1，XKCM1)的作用[29]，最终形成稳定的中心体微管。与此同时，AURKA也可以直接磷酸化MCAK来影响双极纺锤体形成[30]。因此，在有丝分裂中AURKA可调控中心体纺锤体组装。

在大多数雌性哺乳动物卵母细胞中无中心粒，其纺锤体的形成不同于体细胞的有丝分裂进程。卵母细胞纺锤体组装依赖于凝聚染色体周围的微管自发成核，形成多个微管组织中心，在功能上取代中心体完成纺锤体组装[31]。在卵母细胞纺锤体组装过程中，多个MTOCs先破碎成大量的小MTOCs碎片，然后再合并成两个相等的纺锤体极[32]。MTOCs虽然无中心粒，但含有中心粒周围物质成分，包括γ-微管(γ-tubulin)和中心粒周蛋白(pericentrin，PCNT)[9]。在卵母细胞中，AURKA与MTOCs主要蛋白γ-微管[33]和PCNT[34]共定位于纺锤体两极，提示AURKA可能与MTOCs调控纺锤体组装相关。进一步研究发现，AURKA是一个关键的MTOCs相关成分，整个减数分裂期间AURKA与MTOCs共定位，在长时间的卵母细胞减数分裂前期停滞恢复后，AURKA通过招募γ-微管和PCNT触发微管成核[35- 36]，驱动MTOCs介导纺锤体组装[37]。抑制剂抑制AURKA导致MTOCs的大小和数量减少，微管成核的启动延迟[9]。基因敲除AURKA，小鼠卵母细胞中γ-微管与中心蛋白的共定位信号消失，集聚的MTOCs分离[11，38]。Ding等[8]实验证实，在MI卵母细胞中，小干扰RNA干扰AURKA导致MTOCs在两极的定位发生紊乱，分散于纺锤体周围区域。以上实验结果表明，在卵母细胞减数分裂过程中，AURKA是MTOCs介导纺锤体形成所必需的。

由上可知，虽然在有丝分裂和卵母细胞减数分裂纺锤体形成过程中，二者的纺锤体极分别通过中心体和MTOCs介导成核，成核的途径和过程有所不同，但二者的成核过程均离不开AURKA的参与。有丝分裂过程中，AURKA通过TACC-ch-TOG/XMAP215途径，招募γ-微管和PCNT，介导中心体成核；在卵母细胞减数分裂过程中，AURKA同样可以招募γ-微管和PCNT，介导MTOCs成核。但在卵母细胞减数分裂过程中，AURKA是通过何种途径招募γ-微管和PCNT尚不可知。

AURKA维持纺锤体组装检查点活性

动粒-微管的精确附着是调控染色体正确分离的关键，SAC是一种监视机制，在双极纺锤体组装过程中监控动粒与微管附着[39]。在体细胞动粒-微管正确附着前，SAC抑制后期促进复合物/环体(anaphase-promoting complex/cyclosome，APC/C)活性，致使分离酶被保全素(securin)抑制，染色体无法分离，SAC将细胞阻滞在中期。一旦所有的动粒均连接到微管上，SAC沉默，纺锤体检查点上的有丝分裂阻滞缺陷蛋白2(mitotic arrest-deficie protein 2，MAD2)对细胞周期蛋白20(cell division cycle 20，Cdc20)的抑制被解除，Cdc20结合并激活APC/C，活化的APC/C泛素化降解细胞周期蛋白B(cyclin B)和保全素。失去保全素的抑制作用，水解酶触发染色体发生分离，细胞进入后期[40- 41]。人类体细胞中，SAC信号的有丝分裂检查点复合体由MAD2、BubR1、Bub3、Cdc20蛋白组成，MAD2存在于未与微管发生附着的动粒上[42]。已有研究表明，在pre-MI期，活化的AURKA维持MAD2处于非附着动粒以及维持SAC的功能正常。抑制AURKA导致MAD2从动粒上移除，SAC失活，致使姐妹染色单体过早分离，产生非整倍体[43]。在人肿瘤细胞中使用AURKA特异性抑制剂MLN8045抑制AURKA活性，导致部分纺锤体极中心体缺失、染色体排列紊乱、后期染色体迟滞以及染色体非整倍率上升[44]。

在卵母细胞减数分裂进程中，MAD2位于pre-MI期卵母细胞的着丝粒上，一旦卵母细胞进入MI期，所有染色体排列在纺锤体赤道板处，MAD2在着丝粒上的信号消失[45- 46]。在动粒-微管正确附着前，AURKA通过招募MAD2到卵母细胞动粒上，发挥防止APC/C活化、维持SAC活性的作用。抑制AURKA导致MAD2提前从动粒区域移除[47]，染色体过早进入后期，表明抑制AURKA会扰乱MAD2的定位，进而导致SAC失活[48- 49]。

由上可知，在有丝分裂和卵母细胞减数分裂中，AURKA均是保持SAC活性、调控染色体正确分离所必须的，其功能异常可导致姐妹染色单体过早分离，染色体非整倍率上升。

AURKA调控动粒-微管正确附着

动粒-微管的精确连接是调控染色体正确分离的关键。染色体准确分离依赖于动粒-微管之间的核分裂周期蛋白80 (nuclear division cycle 80，NDC80)复合体[50]。NDC80复合体的主要成分动粒蛋白Hec1是AURKA的靶因子之一，也是产生稳定的动粒-微管附着的主要动粒蛋白。在有丝分裂中，当错误的动粒-微管附着体靠近纺锤体极时，AURKA通过磷酸化染色体上的Hec1来破坏附着体的稳定性[51]。而抑制AURKA活性后，错误附着体在近纺锤体极区域仍可保持稳定，致使染色体分离错误率上升，这表明AURKA在体细胞纺锤体极附近有较高的活性，可以破坏错误附着体的稳定性，以确保染色体的准确分离[47]。

Cairo等[52]研究发现，AURKA在卵母细胞中也有类似的功能。前期至前中期，纺锤体极附近AURKA选择性地高水平磷酸化错误附着体Hec1，以破坏错误附着体的稳定性；在中期，AURKA维持低水平且持续的磷酸化水平，既有利于正确的动粒-微管附着的稳定性，也有利于染色体整齐地排列在赤道板上[53]。研究发现，AURKA在中期介导的动粒底物磷酸化至少有两种机制：一种是内着丝粒蛋白(inner centromere protein，INCENP)招募AURKA到着丝粒区域，进而磷酸化Hec1，破坏错误附着体的稳定性，这不依赖染色体到纺锤体极的距离[53]。另一种是错误附着体染色体对的动粒缺乏张力[54]，并被拉向其中一个纺锤极附近，随后被该区域的AURKA磷酸化，破坏其稳定性[51]。与有丝分裂相类似，在卵母细胞减数分裂后期，AURKA也开始降解，这样既有利于形成稳定的动粒-微管连接来驱动染色体分离，又有利于防止正确的动粒-微管附着体在后期接近纺锤体极时被破坏[55]。

由上可知，在有丝分裂和减数分裂进程中，位于纺锤体极处的AURKA均可选择性地破坏动粒-微管错误附着体，以允许形成新的附着体，确保中期染色体动粒-微管的正确附着，驱使染色体整齐地排列在赤道板上。AURKA功能异常均可导致动粒-微管错误附着致使染色体分离错误以及产生非整倍体卵母细胞。

总结与展望

本文从AURKA在体细胞有丝分裂和卵母细胞减数分裂中的细胞定位、活化机制以及在调控纺锤体形成、SAC活化、动粒-微管附着纠错中的作用方面展开综述，发现AURKA在体细胞有丝分裂和卵母细胞减数分裂进程中的作用基本相同，如均定位于纺锤体两极，均可被TPX2以及Bora激活，均可介导纺锤体极的成核、SAC活化以及动粒-微管附着纠错。但与有丝分裂AURKA参与纺锤体组装调控机制方面的研究相比，卵母细胞减数分裂进程中AURKA的作用机制仍不够透彻，如在有丝分裂过程中，AURKA通过TACC-ch-TOG/XMAP215途径，招募γ-微管和PCNT，介导中心体成核。然而在卵母细胞减数分裂过程中，AURKA是通过何种途径招募γ-微管和PCNT介导MTOCs成核的尚不可知。此外，在有丝分裂后期，AURKA在赤道板中间区有定位信号，而类似的信号并未在卵母细胞的两次减数分裂后期出现，这表明，在有丝分裂和卵母细胞减数分裂之间AURKA的功能并不完全相同，AURKA在卵母细胞减数分裂后期赤道板中间区的作用可能被其他因子所替代，具体机制仍需进一步研究。在此基础上，近年来一些学者开始对AURKs家族中AURKB和AURKC的功能产生兴趣并开展研究，但两者的功能尚未被系统阐明。以上问题均有待于进一步研究，以揭示细胞分裂调控机制，并为癌症和生殖等相关临床研究奠定理论基础。