卵巢癌HELQ蛋白结构和功能的生物信息学工具分析预测

李亚萍，邹余粮，张琳，黄新，秦勇

(1西安市中心医院，西安710003；2西安交通大学第一附属医院)

卵巢癌HELQ蛋白结构和功能的生物信息学工具分析预测

李亚萍1，邹余粮2，张琳1，黄新1，秦勇1

(1西安市中心医院，西安710003；2西安交通大学第一附属医院)

目的预测卵巢癌抑癌基因HELQ编码蛋白(HELQ蛋白)的结构和功能。方法采用ExPASy服务器中的工具分析HELQ蛋白的理化特征。分别采用PSORTⅡ和TMHMM预测HELQ蛋白的亚细胞定位和跨膜拓扑结构。采用SignalP 4.0预测HELQ蛋白的信号肽。采用ScanProsite和SMART分析HELQ蛋白的功能结构域以及结构域分区。采用PSIPRED和I-TASSER预测HELQ蛋白的二级和三级结构以及配体结合位点。采用STRING 10.0预测HELQ蛋白与其他蛋白的交互作用。结果HELQ蛋白主要定位在细胞核(47.8%)和细胞质(39.1%)中，有4个保守结构域DEXDc、HELICc、HHH_5和PRK02362，并包含解旋酶ATP结合区和解旋酶C端结合区两个功能结构域；成功建立了HELQ蛋白的二级和三级结构模型，其中二级结构中α螺旋、无规则卷曲及折叠结构比例分别为54%、31%和6%。三维配体结构分析发现HELQ蛋白包含一个酶活性中心位点His341，催化Ile333、Lys335、Tyr337、Gln340、Pro360、Thr361、Ser362、Gly363、Gly364、Lys365、Thr366、Leu367、Glu464和Ala711等结合位点与配体ATP结合。交联蛋白质分析发现HELQ蛋白可能与RAD51、POLA1、PLON、FANCD2、DHX8等蛋白存在交互作用。结论HELQ蛋白可能具有ATP依赖性解旋酶的结构和功能，参与DNA损伤的修复过程。

卵巢癌；HELQ基因；HELQ蛋白；三级结构；ATP依赖性解旋酶

Abstract:ObjectiveTo predict the structure and function of ovarian cancer anti-tumor gene HELQ protein.MethodsThe tools of ExPASy Server were employed to analyze the physicochemical properties of HELQ protein. Its subcellular localization and transmembrane topology were predicted by PSORTⅡand TMHMM, respectively. The signal peptide of HELQ was predicted by SignalP 4.0. ScanProsite and NCBI conserved domain search data were used to analyze the function domain and conserved domain. PSIPRED and I-TASSER were employed to construct the secondary structure and three-dimensional model and find the ligand binding sites of HELQ. STRING 10.0 was used to predict the interaction of HELQ with other proteins.ResultsThe HELQ protein was mainly located in the nucleus (47.8%) and cytoplasm (39.1%). HELQ had 4 conserved domains, consisting of DEAD, HELICc, HHH_5, and PRK02362, and contained 2 function domains: Helicase_ATP-Bind_1 and Helicase_Cter. The secondary structure and three-dimensional model were constructed. In the secondary structure, HELQ was composed of α helix (54%), random coils (31%), and 10.26% β-structure. The results of three-dimensional model found that HELQ had a enzyme activity site His341 and the ligand binding sites appeared in Ile333, Lys335, Tyr337, Gln340, Pro360, Thr361, Ser362, Gly363, Gly364, Lys365, Thr366, Leu367, Glu464 and Ala711 which combined with ATP. The result of cross-linked protein analysis discovered that HELQ might be interaction with RAD51, POLA1, PLON, FANCD2, and DHX8.ConclusionHELQ protein may have ATP-dependent helicase structure and function, and participate in the DNA damage repair process.

Keywords: ovarian carcinoma; HELQ gene; HELQ protein; tertiary structure; ATP-dependent helicase

卵巢癌是女性常见癌症的第二大杀手，早期难以诊断，且预后效果较差，5年生存率约47%[1]。对卵巢癌发生的相关基因的研究，能够为早期诊断和靶向治疗卵巢癌提供方向。HELQ基因是2013年在小鼠体内发现的卵巢癌抑癌基因，该基因缺失时会增加小鼠患卵巢癌的风险[2]。已有研究表明，HELQ基因可以修复细胞增殖时DNA复制过程中发生的DNA损伤，如果该基因发生缺陷或缺失，DNA错误复制的可能性会增加，从而提高恶性肿瘤发生的几率[3]。因而笔者推测，如果HELQ基因在人类和小鼠中的作用一致，未来或许可通过筛查HELQ基因来诊断和治疗女性卵巢癌。但纵观国内外研究，关于该基因的研究尚不够成熟，该基因表达蛋白的结构及功能也不明确。本研究利用生物信息学工具预测HELQ基因编码蛋白(HELQ蛋白)的结构和功能。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 HELQ基因序列的来源 从NCBI数据库中获取HELQ基因的核苷酸序列，其Genbank序号为AF436845.1，Gene ID:113510，定位于染色体4q21上。HELQ基因又称HEL308，全长3591 bp，ORF finder分析HELQ基因序列包含17个开放阅读框，其中ORF3编码基因的全长，共1101个氨基酸。

1.2 HELQ蛋白结构和功能的预测 用ExPASy服务器[4]中的ProtParam、Compute pI/Mw和ProtScale软件预测HELQ蛋白的理化性质，包括氨基酸组成、分子质量、等电点、疏水性/亲水性、不稳定系数及脂肪系数等。用PSORTⅡ(http://www.genscript.com/psort.html)预测HELQ蛋白的亚细胞定位。用TMHMM软件[5]预测HELQ蛋白的跨膜拓扑结构。用SignalP4.0 Server软件[6]预测HELQ蛋白的信号肽。用ScanProsite软件[7]预测HELQ蛋白的功能结构域。用NCBI保守结构域数据库[8]分析蛋白序列的保守结构域。用PSIPRED序列分析软件[9]预测HELQ蛋白的二级结构。用蛋白质结构建模工具I-TASSER[10～13]构建HELQ蛋白的三维结构模型，并分析其配体结合位点及其配体。使用STRING 10.0软件[14]分析HELQ蛋白与其他蛋白交联的相互作用。软件使用方法参照软件使用说明书或自带的使用教程。

2 结果

2.1 HELQ蛋白的理化性质 Prot Param软件计算出HELQ蛋白的分子量约为124 175.3 Da，理论等电点为6.12，氨基酸组成中酸性氨基酸多于碱性氨基酸，且亮氨酸(Leu)比例最高(12.4%)；不稳定指数为45.55，故推测HELQ应为不稳定的酸性蛋白。Prot Scale软件计算出HELQ蛋白疏水性指数平均值为-0.317，脂肪族指数为92.34，说明其为亲脂性蛋白。

2.2 HELQ蛋白亚细胞定位及结构域 PSORTⅡ软件计算出HELQ蛋白最大可能分布在细胞核(47.8%)和细胞质(39.1%)中，也可能出现在线粒体及囊泡分泌系统(高尔基体、内质网等结构)中，TMHMM和SignalP4.0计算结果显示HELQ蛋白没有跨膜结构域及信号肽，说明该蛋白可能不是跨膜蛋白及内分泌蛋白，而可能是代谢调控蛋白或转录因子。

Scan Prosite软件预测HELQ蛋白的功能结构域，结果显示HELQ蛋白包含两个功能结构域，分别是Helicase_ATP-Bind_1(解旋酶ATP结合区A)和Helicase_Cter(解旋酶C端结合区)，其功能分别是结合和水解ATP。通过查找NCBI 保守结构域数据库，发现HELQ序列有4个保守结构域，分别是DEAD(解旋酶家族成员之一)、HELICc(解旋酶C端超级结构域)、HHH-5(复合螺旋结构域)和PRK02362(ski2_like结构域)，其中DEAD参与各种RNA代谢过程，包括核转录、前信使RNA剪接、核糖体合成、核质运输、翻译、RNA衰变以及细胞器基因的表达。

2.3 HELQ蛋白的二级和三级结构 PSIPRED软件构建出的HELQ蛋白二级结构模型显示HELQ蛋白由α-螺旋(54%)和无规则卷曲(31%)、 β-折叠(6%)组成。I-TASSER软件构建出了HELQ蛋白三维结构模型，结合3DLigandsite软件建立HELQ蛋白三维配体结合模型，发现其可能结合的配体为ATP，结合位点为Ile333、Lys335、Tyr337、Gln340、360Pro、361Thr 、Ser362、Gly363、Gly364、Lys365、Thr366、Leu367、464Glu、711Ala，且主要分布在Helicase_ATP-Bind_1和Helicase_Cter两个功能结构域；另外，结合位点中心区域的His341为HELQ蛋白的酶活性中心位点，因此，推测HELQ的活性依赖于与ATP结合从而提供的能量。

2.4 HELQ蛋白的交联网络 STRING 10.0交互式数据库蛋白质交联分析结果显示与HELQ蛋白相互作用的蛋白主要有RAD51、POLA1、PLON、FANCD2、DHX8 等。其中RAD51具有DNA依赖的ATP酶活性，参与同源重组和双链断裂时的DNA损伤修复的激活；PLON是一种DNA聚合酶；FANCD2参与DNA双链断裂的修复过程，维持染色体的稳定。而HELQ与这些蛋白存在交互作用，因此推测HELQ的功能作用与这些蛋白相似，也与DNA复制有关，即可能参与修复细胞增殖时DNA复制过程中所发生的的DNA损伤。

3 讨论

DNA修复是细胞对DNA损伤的一种反应，可使DNA结构恢复重新执行原来的功能。若DNA的损伤未被完全消除，且细胞能够耐受这种损伤继续生存，那么该DNA损伤有很大几率会在适合的条件下显示出来，如导致细胞癌变。因此，DNA损伤修复与肿瘤的发生密切相关。DNA解旋酶可以修复核苷酸的错配、双链断裂及同源重组交叉反应等DNA损伤，对于维持机体基因及染色体的稳定至关重要。不同的解旋酶(如RuvAB、RecBCD、RecQ1等)修复不同的DNA损伤[15,16]。研究已经证实小鼠体内该基因的缺失可以提高卵巢癌的发病率[2]。Moldovan等[17]研究发现，人的HELQ蛋白表达缺失同样可以引起DNA复制过程受阻，且其他研究[18]也进一步证实HELQ蛋白是一种依赖ATP的酶，具有DNA解旋酶活性，参与细胞的增殖过程。本研究结果显示，HELQ蛋白包含Helicase_ATP_Bind 1和 Helicase_Cter两个中心区域，功能分别是结合和水解ATP，行使解旋酶的活性；蛋白质交联网络分析发现与HELQ相互交联的蛋白均具有修复DNA损伤的功能，其中RAD51协同同系产物(如RAD51B、RAD51D)在DNA损伤的末端形成核蛋白丝，催化断裂的DNA双链与同源DNA姐妹链进行链间重组交换，从而维持基因的稳定性[19]。RAD51是DNA 同源重组修复过程中的关键酶，与BRCA1、BRCA2相互协作，干扰DNA损伤修复，引起基因组的不稳定性，诱导乳腺癌等多种肿瘤的发生[20,21]。PLON是由POLH基因编码的DNA聚合酶ν，修复紫外辐射导致的DNA嘧啶二聚体，使DNA的复制正常进行[18]。FANCD2在应对DNA损伤时第561位的赖氨酸单泛素化，在核中特定位点与FA通路下游相关修复蛋白共定位，修复损伤DNA。FANCD2基因是FA通路的关键基因，若缺失则导致DNA损伤修复功能障碍，引发癌症[22,23]。HDX8是一种依赖ATP的RNA解旋酶。因此推测HELQ 蛋白也具有解旋酶的功能。

已有研究表明人类HELQ蛋白在卵巢、精巢、心脏及骨骼肌均表达，且HELQ蛋白表达与生殖细胞的发育密切相关。HELQ基因发生突变后，导致男性出现少精、唯支持细胞综合症、女性卵巢功能不全而不孕[24,25]。目前的研究集中于对HELQ蛋白功能的探索，Ward等[26]研究发现HELQ联合RAD51修复减数分裂时DNA双链的断裂。Luebben等[27]研究发现哺乳动物的HELQ蛋白具有维持基因稳定的功能。但其与肿瘤发生发展的关系需进一步研究。Liu等[28]研究发现HELQ激活与DNA损伤相关的CHK1-RAD51，抑制骨肉瘤的生长；敲除HELQ基因导致骨肉瘤的增殖和迁移能力增强。因此推测人类HELQ蛋白表达的缺失可能引起恶性肿瘤尤其是生殖系统肿瘤卵巢癌的发生。

本研究对HELQ蛋白的结构及功能进行了分析，初步推测其可能参与肿瘤发生发展过程中的DNA损伤修复过程，从而影响恶性肿瘤细胞的增殖以及肿瘤治疗过程中的治疗效果。HELQ基因和蛋白与卵巢癌的关系有进一步研究的价值。

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Bioinformatics analysis and prediction of HELQ protein structure and function

LIYaping1,ZOUYuliang,ZHANGLin,HUANGXin,QINYong

(1Xi'anCentralHospital,Xi'an710003,China)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.35.009

R737.3

A

1002-266X(2017)35-0029-04

2017-03-22)

陕西省科学技术研究发展计划项目(2013JM4064)。