急性白血病患儿骨髓单个核细胞CREB、Bcl-2的表达及其与病灶髓外浸润和预后的关系

郑转珍,李国霞,张耀方,徐丽娟,朱镭

(1山西医科大学第二临床医学院，太原030001；2 山西省妇幼保健院)

急性白血病患儿骨髓单个核细胞CREB、Bcl-2的表达及其与病灶髓外浸润和预后的关系

郑转珍1,李国霞1,张耀方1,徐丽娟1,朱镭2

(1山西医科大学第二临床医学院，太原030001；2山西省妇幼保健院)

目的观察急性白血病(AL)患儿 骨髓单个核细胞中CAMP反应元件型结合因子(CREB)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2) mRNA和蛋白的表达变化，并探讨其与AL患儿髓外浸润、预后的关系。方法选择2015年2月～2017年3月收治的96例AL患儿，其中急性淋巴细胞白血病(ALL)61例为ALL组，急性髓细胞白血病(AML)35例为对照组，另取骨髓穿刺排除白血病的其他血液病患儿35例为对照组。均行骨髓穿刺抽取骨髓组织分离单个核细胞，用实时荧光定量PCR法测算其中CREB、Bcl-2 mRNA相对表达量，用Western blotting法测算其中CREB、Bcl-2 蛋白相对表达量，并进行组间比较。将ALL、AML组患儿按是否存在髓外浸润分为髓外浸润亚组和无髓外浸润亚组，按化疗后是否缓解分为缓解亚组和未缓解亚组，比较各亚组CREB、Bcl-2 mRNA和蛋白相对表达量。结果ALL、AML组骨髓单个核细胞中CREB、Bcl-2 mRNA和蛋白相对表达量均高于对照组(P均<0.05)。ALL组和AML组骨髓单个核细胞CREB、Bcl-2 mRNA和蛋白相对表达量相比，P均>0.05。ALL、AML组中有髓外浸润亚组患儿骨髓单个核细胞中CREB、Bcl-2 mRNA和蛋白相对表达量均高于各自的无髓外浸润亚组(P均<0.05)。ALL、AML组中缓解亚组患儿骨髓单个核细胞中CREB、Bcl-2 mRNA和蛋白相对表达量均高于各自的未缓解亚组(P均<0.05)。结论AL患儿骨髓单个核细胞中CREB、Bcl-2 mRNA和蛋白高表达，且表达量与髓外浸润和患儿预后有关。

急性白血病；急性淋巴细胞白血病；急性髓细胞白血病；骨髓；单个核细胞；CAMP反应元件结合蛋白；B淋巴细胞瘤-2

急性白血病(AL)作为多发于儿童时期的一类常见的血液性恶性肿瘤，对患儿的生命安全具有较大的威胁。该病发病机制不明确，复发率高，髓外浸润多见，影响长期生存，治疗难度较大。寻找AL的相关基因并用其辅助AL诊治具有重要的临床意义[1]。CAMP反应元件结合蛋白(CREB)属于核转录调节因子，有利于细胞的存活与增殖，还可对细胞凋亡产生抑制，参与正常机体的造血功能及慢性白血病的发生发展[2]，但其与AL的关系尚不明确。B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)属于凋亡抑制基因，其同恶性肿瘤的形成紧密相关[3，4]，但Bcl-2与AL关系的相关研究相对较少。本研究观察了AL患儿骨髓单个核细胞CREB、Bcl-2 mRNA和蛋白的表达变化，并探讨其与AL患儿髓外浸润、预后的关系。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2015年2月～2017年3月收治的96例AL患儿。入选标准：①患儿均经骨髓穿刺病例活检确诊；②年龄<14岁；③初诊的患儿。排除标准：①其他类型的恶性血液性疾病；②继发于其他恶性肿瘤者；③有严重的心、肝、肾等脏器的功能性不全者。其中急性淋巴细胞白血病(ALL)61例，为ALL组。ALL组男32例、女29例，年龄3～12(6.24±1.07)岁。B细胞型20例，T细胞型41例。有髓外浸润46例，无髓外浸润15例。均采用标准VDLP方案(长春新碱+柔红霉素+泼尼松+左旋门冬酰胺酶)治疗1个月，缓解(完全缓解+部分缓解)48例，未缓解13例。急性髓细胞白血病(AML)35例为AML组。男22例、女13例，年龄4～13(6.27±1.12)岁。M1型7例，M2型19例，M4型6例，M5型3例。有髓外浸润27例，无髓外浸润8例。均采用DAE方案(柔红霉素+阿糖胞苷+VP16)治疗1个月，缓解24例，未缓解11例。另选同期收治的骨髓穿刺排除白血病的35例血液病患儿为对照组。男25例、女10例，年龄3～12(6.25±1.09)岁。其中感染性疾病15例，缺铁型贫血14例，血小板减少型紫癜6例。各组患儿性别、年龄等一般资料相比P均>0.05。本研究的内容和方法已经我院医学伦理委员会批准，患儿监护人均签署知情同意书。

1.2 各组患儿骨髓单个核细胞CREB、Bcl-2 mRNA检测 取各组患儿骨髓穿刺所得骨髓组织，用天津浩洋公司生产的Ficoll液分离单个核细胞，采用实时荧光定量PCR法测算其中CREB、Bcl-2 mRNA相对表达量。先用购于美国MBI公司的RNA提取试剂盒对细胞的RNA进行提取，操作过程应严格遵照说明书的步骤施行。然后行实时荧光定量PCR，试剂盒购自美国MBI公司，操作按试剂盒说明书进行。CREB引物序列：正向5′-GACTTTCTCCGGAACTCA-3′，反向5′-CGGTACCATTGCTAGCCAG-3′，扩增片段长度312 bp。Bcl-2引物序列：正向5′-CGCTTTGCCACGGTGGTGGAG-3′，反向5′-GTACATCACTGACAATGC-3′，扩增片段长度415 bp。内参照β-actin引物序列：正向5′-TTAGCTGTGCTCGCGCTACTCTCTCTC-3′，反向5′-GTCGGATTGATGAAACCCAGACACA-3′，扩增片段长度168 bp。PCR反应条件为94 ℃ 5 min，64 ℃1 min，后退火(其中CREB为55 ℃，Bcl-2为60 ℃，β-actin为50 ℃)约1 min，72 ℃ 2 min，72 ℃ 5 min，共40个循环。将10μL的PCR产物放于20 g/L的琼脂糖凝胶中电泳，凝胶成像系统分析，用2-ΔΔCt表示CREB、Bcl-2 mRNA相对表达量。

1.3 各组患儿骨髓单个核细胞CREB、Bcl-2 蛋白检测 采用Western blotting法。取按1.2方法分离的骨髓单个核细胞，加入细胞裂解液裂解，心收集蛋白，用Western blotting法检测CREB、Bcl-2 蛋白相对表达量。操作按试剂盒说明书进行。CREB、Bcl-2 蛋白相对表达量以CREB、Bcl-2 蛋白条带与内参照GADPH条带灰度值的比值表示。

2 结果

2.1 各组骨髓单个核细胞CREB、Bcl-2mRNA及蛋白相对表达量比较 各组骨髓单个核细胞CREB、Bcl-2mRNA及蛋白相对表达量见表1。ALL、AML组骨髓单个核细胞中CREB、Bcl-2 mRNA和蛋白相对表达量均高于对照组(P均<0.05)。ALL组和AML组骨髓单个核细胞CREB、Bcl-2 mRNA和蛋白相对表达量相比,P均>0.05。

表1 各组患儿骨髓单个核细胞CREB、Bcl-2的mRNA和蛋白相对表达量比较

注：与对照组相比，*P<0.05。

2.2 有、无髓外浸润亚组患儿骨髓单个核细胞中CREB、Bcl-2 mRNA和蛋白相对表达量比较 ALL、AML组中有、无髓外浸润亚组患儿骨髓单个核细胞中CREB、Bcl-2 mRNA和蛋白相对表达量见表2。ALL、AML组中有髓外浸润亚组患儿骨髓单个核细胞中CREB、Bcl-2 mRNA和蛋白相对表达量均高于各自的无髓外浸润亚组(P均<0.05)。

表2 有、无髓外浸润亚组患儿骨髓单个核细胞CREB、Bcl-2的mRNA和蛋白相对表达量比较

注：与无髓外浸润组相比，*P<0.05。

2.3 缓解、未缓解亚组患儿骨髓单个核细胞中CREB、Bcl-2 mRNA和蛋白相对表达量比较 ALL、AML组中缓解、未缓解亚组患儿骨髓单个核细胞中CREB、Bcl-2 mRNA和蛋白相对表达量见表3。ALL、AML组中缓解亚组患儿骨髓单个核细胞中CREB、Bcl-2 mRNA和蛋白相对表达量均高于各自的未缓解亚组(P均<0.05)。

表3 缓解、未缓解亚组患儿骨髓单个核细胞CREB、Bcl-2的mRNA和蛋白相对表达量比较

注：与未缓解组相比，*P<0.05。

3 讨论

骨髓细胞基因转录主要受转录因子的调控[5]。CREB属于CREB/ATF-1这一重要转录因子家族的成员。在多类癌症中均已发现CREB处于高表达状态。Bcl-2蛋白由Bcl-2原癌基因编码，其高表达可以促进癌细胞存活。有报道指出[6～8]，AL的发病机制主要是增殖失控、分化障碍和细胞凋亡抑制。造血细胞的非正常恶性增殖及凋亡受抑也与患者预后有关[9～11]。为进一步明确CREB、Bcl-2与AL的关系，我们观察了AL患儿骨髓单个核细胞CREB、Bcl-2 mRNA和蛋白的表达变化，并探讨其与AL患儿髓外浸润、预后的关系。结果显示ALL、AML组患儿骨髓单个核细胞中CREB、Bcl-2 mRNA和蛋白相对表达量高于对照组，ALL、AML组间比较差异无统计学意义。这与文川等[12～14]的报道结果类似，提示无论是ALL还是AML，患儿骨髓单个核细胞中CREB、Bcl-2 mRNA和蛋白的表达均上升。分析原因，主要可能与CREB和Bcl-2在癌细胞中的作用机制及白血病的发病机制有关。CREB的高表达则可能是通过某种信号通路对Bcl-2在白血病的有关发病进程中的表达进行上调而实现的。换言之，CREB及Bcl-2的高表达均可能是ALL及AML的部分发病共同机制，因此二者在ALL组和AML组中的表达水平均明显上升。本研究还发现，ALL、AML患儿髓外浸润亚组骨髓单个核细胞中CREB、Bcl-2 mRNA和蛋白相对表达量均高于各自的无髓外浸润亚组。这提示了CREB及Bcl-2在有髓外浸润的白血病患儿中更易表现出高表达状态。原因可能是因为髓外浸润易使病情进展，终使二者均呈现出高表达。此外，ALL、AML组缓解亚组骨髓单个核细胞中CREB、Bcl-2 mRNA和蛋白相对表达量均高于未缓解亚组。这提示了经过相应的治疗后，症状缓解的白血病患儿骨髓细胞中CREB和Bcl-2的表达明显下调。原因可能是因为化疗药物的作用杀死了部分癌细胞，阻断了白血病有关细胞的异常增殖过程，最终干扰了CREB和Bcl-2在细胞中的表达，并使二者均下调[15]。

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2017-06-28)

山西省科技攻关项目(20120313020-6)。