子痫前期产妇胎盘组织miR-30家族miRNA及其下游基因表达变化

许敏，李燕，李惠梅，许金环，吕述彦

(南京医科大学附属淮安第一医院,江苏淮安223300)

子痫前期产妇胎盘组织miR-30家族miRNA及其下游基因表达变化

许敏，李燕，李惠梅，许金环，吕述彦

(南京医科大学附属淮安第一医院,江苏淮安223300)

目的观察子痫前期产妇胎盘组织miR-30家族miRNA(miR-30a-5p、 miR-30a-3p、miR-30b、 miR-30d、miR-30e-3p)及其下游基因表达变化。方法选取26例子痫前期产妇为观察组，38例健康产妇为对照组，均采用剖宫产分娩，取其胎盘组织。用实时荧光定量PCR法检测两组产妇胎盘miR-30a-5p、 miR-30a-3p、miR-30b、 miR-30d、miR-30e-3p及其下游靶基因(用生物信息学网站Target Scan预测)的表达。结果观察组产妇胎盘组织miR-30a-5p、miR-30a-3p、miR-30b、miR-30d、miR-30e-3p表达量分别为1.08±0.69、0.61±0.39、0.77±0.68、1.86±1.87、0.39±0.22，对照组分别为0.97±0.47、0.33±0.25、0.30±0.23、2.72±1.55、0.25±0.20。观察组miR-30a-3p、miR-30b、miR-30e-3p、miR-30d表达量与对照组相比P均<0.05。生物学信息分析发现CCNT2、ZFAT是miR30家族miRNA的下游基因。观察组胎盘组织CCNT2、ZFAT mRNA表达量分别为0.40±0.24、0.16±0.11，对照组分别为0.14±0.13、0.09±0.05。两组胎盘组织CCNT2、ZFAT mRNA表达量相比，P均<0.05。结论子痫前期产妇胎盘组织miR-30家族miR-30a-3p、miR-30b、miR-30e-3p表达升高，miR-30d表达降低，其下游靶基因CCNT2、ZFAT表达升高。

微小RNA；微小RNA30；CCNT2基因；ZFAT基因；妊娠并发症；子痫前期；胎盘

子痫前期(PE)是妊娠20周后出现的特发性妊娠期综合征，以初发高血压及蛋白尿为主要特征。PE的全球发病率约占2%～8%，是导致孕、产妇死亡的重要原因[1]。胎盘缺血缺氧、血管内皮损伤、免疫等多种因素导致滋养细胞功能障碍、胎盘灌注不足，进而引起胎盘功能异常是PE发生发展的主要原因。小RNA(miRNA)通过抑制mRNA翻译或诱导其降解在转录后水平发挥调控基因表达的作用。有研究[2]发现miR-155通过下调CYR61参与PE的发生发展。我们前期通过miRNA芯片筛检了PE相关的miRNA表达，发现部分miR-30家族miRNA(miR-30a-5p、miR-30a-3p、miR-30b、miR-30d和miR-30e-3p)在PE产妇与正常产妇胎盘中的表达存在差异，推测部分miR-30家族的miRNA表达失衡可能与PE发病相关。但是芯片筛检结果只能发现表达差异的miRNA，不能做到定量检测。本研究观察了PE产妇胎盘中部分miR-30家族miRNA(miR-30a-5p、miR-30a-3p、miR-30b、miR-30d和miR-30e-3p)及其下游靶基因(用生物信息学方法预测)的表达变化，探讨miR-30家族在PE发病机制中的作用。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2010年1月～2011年12月在我院正规产检、分娩的产妇PE产妇26例为PE组，健康产妇38例为对照组。PE组年龄(29.88±6.15)岁，24 h尿蛋白(0.47±0.49)g，孕龄(37±2)周，收缩压(151.85±7.20)mmHg，舒张压(85.15±8.37)mmHg。对照组年龄(27.34±4.37)岁，孕龄(37±1)周，收缩压(121.42±6.96)mmHg，舒张压(70.92±6.36)mmHg。两组产妇年龄、孕周相比P均>0.05。分娩方式均为剖宫产。PE定义为妊娠20周后出现收缩压≥140 mmHg和(或)舒张压≥90 mmHg伴24h蛋白尿≥0.3 g或随机尿蛋白(+)。所有产妇血小板、肝功能、肾功能和胎儿体质量都位于正常范围。所有产妇的血压及尿蛋白在产后6周内均恢复了正常。 剔除患有慢性高血压、慢性肾脏疾病、凝血功能障碍、胎膜早破和其他妊娠综合征如胎儿染色体异常的患者。本研究已获得本院伦理委员会的批准，患者及其家属均签署知情同意书。

1.2 miR-30家族miRNA下游基因的生物信息学分析方法 利用生物信息学网站TargetScan(http://www.targetscan.org)进行miR-30家族miRNA下游基因预测，方法参照网站说明。

1.3 两组产妇胎盘组织miR-30家族miRNA及下游基因表达检测 两组产妇产后半小时内收集胎盘母体面中央的绒毛组织置于液氮中-80°保存。产妇用Tiozol试剂按说明书操作提取包括microRNA在内的总RNA。用实时荧光定量PCR法检测两组产妇胎盘组织中miR-30家族miRNA(miR-30a-5p、miR-30a-3p、miR-30b、miR-30d和miR-30e-3p)及其下游基因CCNT2、ZFAT。miR-30家族miRNA检测以U6作为内参，引物见表1。PCR过程：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃30 s。CCNT2、ZFAT mRNA用GAPDH作为内参，PCR过程为，37 ℃15 min，85 ℃30 s。上述操作在ABI 7900HT测序仪上完成，用SDS2.4软件计算每个循环的阈值(Ct)，以2-ΔΔCt表示各目的基因表达量。

表1 实时荧光定量PCR所用的引物序列

2 结果

观察组产妇胎盘组织miR-30a-5p、miR-30a-3p、miR-30b、miR-30d、miR-30e-3p表达量分别为1.08±0.69、0.61±0.39、0.77±0.68、1.86±1.87、0.39±0.22，对照组分别为0.97±0.47、0.33±0.25、0.30±0.23、2.72±1.55、0.25±0.20。两组miR-30a-3p、miR-30b、miR-30e-3p、miR-30d表达量相比P均<0.05,两组miR-30a-5p表达量相比P>0.05。

生物学信息分析发现CCNT2、ZFAT是miR30家族miRNA的下游基因。观察组胎盘组织CCNT2、ZFAT mRNA表达量分别为0.40±0.24、0.16±0.11，对照组分别为0.14±0.13、0.09±0.05。两组胎盘组织CCNT2、ZFAT mRNA表达量相比P均<0.05。

3 讨论

miRNA在真核生物体内普遍存在，其长度约9～22个核苷酸，由60～110核苷酸的内源性转录前体经过Drosha酶和Dicer酶加工而成。miRNA通过与目标mRNA的3′端非编码区(3′-UTR区)的完全或不完全配对引起靶mRNA的降解或抑制其翻译，通过对基因进行转录后表达的调控[3]在细胞增殖、分化以及凋亡等生物过程中发挥重要的调控作用。miRNA有进化高度保守、组织特异性表达、表达时序性等生物学特性。同一miRNA可位于染色体的同一部位共同发挥调控作用，也称基因的簇集性[4]。目前miRNA的研究并不深入，miRNA的染色体定位、与靶基因的作用通路、对组织的调控机制尚不清楚。

PE是由多种因素导致的妊娠期特异性并发症，严重者可导致产妇子痫、肺水肿及肾衰，胎儿生长受限和脑瘫[5]，是导致孕、产妇和新生儿死亡的重要原因[6]。子痫前期的发病机制复杂，目前认为子痫前期的发展分为两个阶段。妊娠早期阶段：在胎盘形成时，血液灌注不足、免疫耐受等多种因素共同导致滋养细胞侵袭不足，螺旋动脉重铸障碍，胎盘缺血缺氧；妊娠晚期阶段：氧化应激、炎症等因素致使胎盘合成大量因子(如IL-1)，引起母体血管内皮功能紊乱，各器官内皮细胞功能障碍，全身小血管痉挛，继而引发子痫前期的一系列临床症状。有研究显示发育不良的胎盘中存在多种异常表达的miRNA，胎盘组织中普遍表达以及病理情况下特殊存在的miRNA能够调节滋养细胞功能以及血管生成，可能与PE发生发展有关。有学者发现miR-29b可诱导滋养层细胞凋亡[7]，另有研究表明miR-155可调控PE患者的血管紧张素受体[8]。然而，miRNA促进PE发生发展的确切机制目前仍不清楚。本研究结果显示PE产妇胎盘中miR-30a-3p、miR-30b和miR-30e-3p表达升高，miR-30d表达降低。

细胞周期由不同时期组成，从G1、S、G2到M期，细胞周期的改变会导致增殖性疾病和肿瘤的发生。CDK家族通过与细胞周期蛋白结合，控制细胞周期。活化和调节支持细胞分裂，并参与转录过程调控[9]。转录延长促进因子P-TEFb是转录必需的细胞因子[10]，CDK9与CCNT2[7]形成异二聚体后活化P-TEFb。活化后的P-TEFb具有广泛的生物活性，包括细胞周期调控、细胞因子转导[11]，并与转录调控因子协同调控启动子区的转录[12]。有学者发现，CDK9通过使RNA聚合酶Ⅱ的C端(CTD)磷酸化，调控细胞的转录延长[13]。本研究结果显示CCNT2在PE患者胎盘中表达明显升高，且生物学信息分析认为CCNT2是miR-30a-3p、miR-30b、miR-30d和miR-30e-3p的下游靶基因。推测差异表达的miR-30家族的miRNA可能是通过CCNT2途径通过调控细胞周期影响细胞的转录及胎盘发育。

ZFAT是具有AT钩和锌指结构域的核蛋白。ZFAT在人类相关疾病的发生发展中起重要作用[14]，有研究报道ZFAT的遗传变异与桥本病[15]、高血压病[16]、脑动脉瘤的发生及上皮性卵巢癌细胞相关[17]。还有学者通过染色质免疫沉淀的方法发现ZFAT主要分布在转录起始位点(TSS)周围，在该位点敲除ZFAT，H3K9ac/K27ac水平降低，表明H3K9ac/K27ac调控与ZFAT有关，并可能是ZFAT在T细胞中发挥重要作用的生物基础[18]。本研究结果显示PE患者胎盘中ZFAT显著高表达，为首次发现。生物信息学研究结果显示，ZFAT可能是miR-30a-3p、miR-30b、miR-30d和miR-30e-3p的下游基因，miR-30a-3p、miR-30b、miR-30d和miR-30e-3p可能通过ZFAT参与PE的发生发展过程。

综上所述，miR-30a-3p、miR-30b、miR-30d、miR-30e-3p及其下游基因CCNT2、ZFAT在PE患者胎盘中表达升高，他们可能相互作用共同促进了PE的发生发展，但具体的作用关系仍需进一步研究。后续我们将进一步扩大样本量，并对差异表达的miRNA和靶基因的关系进行验证，或增加细胞学、蛋白质等层面的研究，进一步探讨差异表达的miR-30家族miRNA在PE发生发展中发挥的具体作用。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2017.35.020

R714.25

B

1002-266X(2017)35-0061-03

2017-02-26)

江苏省妇幼保健科研项目(F201430)。

吕述彦(E-mail: sysky803@aliyun.com)