一种简便、快速、高效适合PCR的真菌DNA提取方法

柴海云 张磊 袁牧歌 朱庆义

(1.广州金域医学检验中心微生物室，广州 510005；2.广州医科大学金域检验学院，广州 511436)

临床常见真菌主要是通过形态观察进行鉴定，但该方法培养时间长，且形态比较接近的真菌难以判定；且有的真菌受某些因素影响导致产孢结构不明显，更难通过形态学进行鉴定。因此，通过分子生物学方法[1]进行真菌鉴定显得越来越重要，真菌ITS[2]序列含有保守区和高度可变区，常用来进行真菌测序鉴定。

然而真菌细胞壁成分复杂，富含多糖、色素、核酸酶等物质，使得真菌DNA提取比较困难；传统DNA提取方法繁琐，且比较费时，所以探索临床常见真菌DNA快速、高效的提取方法十分重要。现有研究表明，酶解消化[3-5]提DNA效率较高，Chelex-100[6-8]可以有效避免DNA在提取过程中的降解，适用于快速提取DNA。因此，本文将两者结合起来，以期探索一种更为高效的DNA提取方法。

1 材料与方法

1.1 材料

实验菌种 实验选用临床收集到的且均通过ITS基因测序鉴定的真菌共34株，涉及近30个不同属的真菌，基本涵盖临床实验室常见真菌。分别为Candida4株，Yeast 4株，Fusarium3株，Cryptococcus、Geotrichum、Trichosporon、Loweporus、Paraconiothyrium、Aspergillus、Talaromyces、Acremonium、Purpureocillium、Curvularia、Absidia、Colletotrichum、Corynascus、Neurospora、Graphium、Hypocrea、Scedosporium、Cladosporium、Phialophora、Phaeosphaeria、Microascus、Trichophyton、Coprinopsis各1株。

试剂 自配DNA提取液：5% Chelex-100，10 mmol/L tris-HCl (pH 8.3)，0.1 mmol/L EDTA-Na2，0.1% NaN3，蛋白酶K (200 μg/mL)，蜗牛酶 (13 mg/mL)；Takara lysis buffer等。

培养基 马铃薯葡萄糖琼脂培养基 (PDA)：称量500 g去皮马铃薯加水2 500 mL，煮沸液体1 h，纱布过滤，滤液定容至1 000 mL，添加20 g葡萄糖和15 g琼脂粉，121℃ 15 min高压灭菌，最后倒平板。

1.2 方法

菌体培养 接种保藏菌液100 μL至上述PDA培养基，然后放于25℃普通培养箱培养3～5 d。

DNA提取 取100 μL无菌水至1.5 mL离心管中，然后用无菌枪头每次挑取一定量的菌丝和 (或)孢子至离心管中使得菌液明显浑浊，然后震荡菌液使其混匀；分别吸取40 μL菌液至两个干净的1.5 mL离心管中，离心、去上清获得两份等重量的菌丝和 (或)孢子，用于提取DNA。

(1)自制DNA提取液 取50 μL提取液到上述含有菌丝和/或孢子的离心管中，然后56℃水浴1 h，接着100℃水浴10 min，最后13 000 r/min 10 min离心获取上清液，该上清液即可做为后续PCR扩增的DNA模板。

(2)Takara lysis buffer 取50 μL Takara lysis buffe裂解液到上述含有菌丝和/或孢子的离心管中，然后85℃水浴孵育30 min，最后13 000 r/min 10 min离心获取上清液，该上清液即可做为后续PCR扩增的DNA模板。

(3)液氮研磨 直接采用上述两种方法均未能成功提出DNA的真菌，在提取之前先对菌体进行液氮研磨，然后再分别利用上述两种试剂提取DNA。

PCR扩增 我们通过真菌ITS基因通用引物ITS4 (5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3')和ITS5 (5'-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3')进行PCR扩增，扩增体系 (25 μL)：2x Taq PCR MasterMix 12.5 μL，双蒸水8.5 μL，引物 (10 μmol/L)各1 μL，DNA模板 (400～500 ng/μL)2 μL；扩增程序：95℃ 5 min，95℃ 1 min，50℃ 1 min，72℃ 1 min，38个循环，72℃ 10 min。扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，对上述不同方法提取的真菌DNA进行评价。

2 结 果

2.1 两种不同DNA提取试剂比较

通过PCR扩增，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，对两种不同试剂提取的DNA进行评价，得到清晰的、单一的PCR扩增条带即为成功。结果34株实验菌株自配试剂成功提取DNA 32株，见图1；市售Takara lysis buffer成功提取DNA 29株，见图2；其中图1a和图2a菌株对应，图1b和图2b菌株对应。实验所选用的真菌属达到近30个，涉及的真菌种属范围广，并且实验过程中尽可能地排除了试剂外其他因素的影响，因此，上述结果有效地证明了自配DNA提取液在DNA提取方面具有高效性的特点。

2.2 DNA浓度、纯度测定

对于上述自配DNA提取液可以成功PCR，而Takara lysis buffer未能成功PCR的5个菌株：Microascus、Phaeosphaeria、Scedosporium、Cladosporium和Phialophora，我们通过Nanodrop对其DNA进行了检测，具体结果如下表1所示。由此可见，两种DNA提取试剂在DNA提取能力、蛋白除杂方面的效果差别不大，但在碳水化合物、盐类等除杂方面，自配试剂的效果明显优于Takara lysis buffer，这应该主要是因为Chelex-100的吸附作用。

2.3 液氮研磨破壁影响

对于直接通过两种试剂都未能成功提出DNA的Trichophyton和Coprinopsis，经液氮破壁，自制试剂成功提出两种真菌DNA，而Takara lysis buffer仅成功提出Coprinopsis的DNA，结果详见表2。这一方面进一步地说明了自制DNA提取液在真菌DNA提取方面的有效性，另一方面说明了在提取某些真菌DNA的时候，应先对菌体进行液氮研磨。

图1 自配新提取DNA试剂对应的PCR电泳图 图2 Takara lysis buffer提取DNA对应的PCR电泳图

Fig.1The agarose gel electrophoresis of PCR amplification products of the new reagentFig.2The agarose gel electrophoresis of PCR amplification products of the Takara lysis buffer

表1 DNA浓度和纯度

3 讨 论

进行分子生物学相关实验时，DNA质量，尤其是DNA 纯度严重影响实验结果，因此高效的DNA提取方法十分重要。本文所述试剂中含有的蜗牛酶是一种混合酶，包括纤维素酶、蛋白水解酶和果胶酶等，通过多种酶的协同作用对真菌细胞壁起到了较好的裂解作用；含有的蛋白酶K，能更有效地阻止核酸酶活性，防止DNA 降解；含有的Chelex-100，是一种由苯乙烯和苯二乙烯组成的独特螯合树脂，可与金属离子结合，阻止金属离子在高温和低离子强度条件下作为催化剂使DNA降解，之后通过离心除去螯合金属离子的Chelex-100颗粒。正是这3种主要成分使得提取的真菌DNA质量相对较高，所提取的DNA适合后续常规PCR扩增。

表2 液氮研磨破壁影响结果

目前，我们已经运用该试剂成功提取了上千株的真菌DNA，并且所提取的DNA也可用于真菌其他靶向基因的扩增，如用于曲霉的BenA基因、CaM基因。该DNA提取液不仅提取效率高，并且操作简便、耗时较短，因此有望成为一种新的DNA提取试剂。在实际运用过程中，对于某些直接提取DNA比较困难的真菌，应在提取之前对菌体进行破壁处理，这样可以进一步提高DNA提取效率。

另外，要注意真菌培养时间不能过长，培养时间过长的真菌产生的代谢产物更多，会对DNA纯度造成一定的影响，从而影响后续PCR。

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