探讨肺曲霉病患者甘露聚糖结合凝集素(MBL)及T细胞亚群的变化

杨燕 滕隔玲 吴艳华 张琳琳 盖丽贞 陈影 胡华

(山东省胸科医院呼吸科，济南 250013)

曲霉在自然界中广泛存在，免疫抑制状态的患者吸入其孢子可导致严重的肺部感染。随着免疫抑制患者的增多，肺曲霉病发生率不断增加。肺曲霉病 (Pulmonary aspergillosis，PA)的发病是一个多因素、多阶段的过程，与机体的免疫功能有着重要的联系。

甘露聚糖结合凝集素 (MBL)是人类肝细胞分泌的高度保守的血浆蛋白，为C型凝集素超家族中胶凝素 (Collectins)家族成员。MBL通过其糖原识别域 (carbohydrate recognition domain，CRD)能够识别多种病原体如细菌、病毒、寄生虫、真菌等表面的糖结构，启动机体的天然免疫系统，抵御病原体的入侵。随着天然免疫研究发现胶凝素家族的一些成员和获得性免疫之间的联系越来越紧密[1]。目前已证实人MBL可与多种免疫细胞结合,调节细胞因子的分泌，进而调控获得性免疫应答的发生和发展[2]。T淋巴细胞在曲霉获得性免疫中起非常重要作用[3-5]。本研究通过检测成人肺曲霉病患者中甘露聚糖结合凝集素 (MBL)的水平、辅助细胞 (CD4+)、杀伤抑制细胞 (CD8+)及调节性T细胞水平，来探讨肺曲霉病与患者免疫功能的关系，为肺曲霉病的免疫增强治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

收集2013年5月～2015年5月在我院呼吸科住院临床确诊肺曲霉病的患者51例，参照美国感染性疾病协会 (IDSA)2008年曲霉病临床实践治疗指南[6]。将纳入对象分为临床确诊：经皮肺穿刺标本或胸水中检出曲霉菌丝及曲霉培养阳性；临床诊断IPA:至少符合1项宿主因素，1项曲霉微生物学标准,且可能感染部位符合1项主要 (或2项次要)临床标准。痰曲霉培养2次以上阳性或经纤维支气管镜作支气管肺泡灌洗液曲霉培养阳性；临床拟诊IPA：至少符合1项宿主因素、1项微生物学标准或可能感染部位符合1项主要 (或2项次要)临床标准。同期健康体检者52例为健康对照组。健康查体者均为在我院常规检查查体人群，并符合以下条件：近3个月无急性呼吸系统感染等相关疾病，且血中白细胞、中性粒细胞比例和ESR在正常范围，胸部X线检查未见异常。本研究经医院伦理委员会批准，所有受试者均签署知情同意书。

1.2 方法

所有入选患者均要收集分析临床资料：性别、年龄、基础疾病、痰液或体液真菌涂片或培养检查、胸部CT、血GM、血MBL、CD3+CD4+T淋巴细胞百分比、CD3+CD8+T淋巴细胞百分比及CD3+CD4+/CD3+CD8+T淋巴细胞比值的检测。

标本和试剂 入选患者均在未抗真菌治疗前抽空腹血清5 mL，留取其上清液置于-20℃冰箱保存。血清MBL试剂盒均购自美国GBD。BIO-RAD model 680，微孔酶标仪系伯乐生命医学产品，购自济南芯博生物科技有限公司。曲霉菌半乳甘露聚糖定量检测试剂盒由丹娜 (天津)生物科技有限公司提供。同时2 mL外周静脉血置于EDTA抗凝管，流式细胞仪为美国BECKMAN COULTER公司的EPLCS.XL.4Clr流式细胞仪。

试验方法 采用固相夹心法酶联免疫吸附试验 (enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)测定，即将标准品及待测样品加入酶标仪反应孔内，与生物素标记的抗体反应，严格按试剂盒说明书进行操作。采用EPLCS.XL.4Clr流式细胞仪进行样本分析，报告CD3+CD4+T淋巴细胞百分比，CD3+CD8+T淋巴细胞百分比及CD3+CD4+/CD3+CD8+T淋巴细胞比值。

2 结 果

2.1 临床资料

所选51例肺曲霉病患者的标准参照美国感染性疾病协会 (IDSA)2008年曲霉病临床实践治疗指南[6]。51例肺曲霉病患者平均年龄49.39±14.25岁，男性29例，女性22例。基础疾病分布情况见表1。所有患者治疗前均给予痰涂片及痰真菌培养、胸部CT及GM、MBL、T细胞亚群检测。确诊11例：经CT引导下肺穿刺病理涂片查到真菌菌丝4例，肺穿刺病灶真菌培养曲霉菌5例，胸腔镜胸膜活检病灶真菌培养曲霉菌2例。拟诊40例:痰真菌培养到曲霉菌21例，气管镜毛刷真菌培养到曲霉菌19例。健康查体者为我院同期查体者，平均年龄42.75±11.33岁，男35例，女性17例。

2.2 胸部CT检查

表1 51例肺曲霉病患者基础疾病分布

51例肺曲霉病患者胸部CT中表现多样化，空洞 (16/51)、实变影 (22/51)、双肺多发不规则结节影 (27/51)、磨玻璃影 (14/51)、囊状或柱状支气管扩张 (24/51)、新月征 (11/51)等。

2.3 血GM、MBL结果

肺曲霉病组 (51例)、健康对照组 (52例)数据正态分布，肺曲霉病组GM的水平较对照组高，P<0.05；肺曲霉病组MBL的水平较对照组低，P<0.05，差异有统计学意义，见表2。

表2肺曲霉病组与健康对照组血清GM、MBL浓度比较

Tab.2The serum GM and MBL levels of patients with pulmonary aspergillosis compared with health people

分组nGM(μg/L)MBL(μg/mL)病例组510．94±0．77197．96±148．16对照组520．32±0．16120．25±98．65P值<0．05<0．05

2.4 血CD3+CD4+淋巴细胞百分比、CD3+CD8+淋巴细胞百分比、CD3+CD4+/CD3+CD8+T淋巴细胞比值比较

肺曲霉病组患者的外周CD3+CD4+T淋巴细胞百分比、CD3+CD4+/CD3+CD8+T淋巴细胞比值均显著降低，差异均有统计学意义，见表3。

表3肺曲霉病组与健康对照组血CD3+CD4+、CD3+CD8+淋巴细胞百分比，CD3+CD4+/CD3+CD8+T淋巴细胞比值

Tab.3Comparison of the percentages of CD3+CD4+T cells,CD3+CD8+T cells and the ratio of CD3+CD4+/CD3+CD8+T cells between patients group and control group

分组CD3+CD3+CD4+%CD3+CD8+%CD3+CD4+/CD3+CD8+病例组69．50±8．7433．07±7．9733．00±8．291．08±0．47对照组69．84±6．3840．32±7．3025．98±6．651．68±0．65P值0．82<0．05<0．05<0．05

3 讨 论

曲霉菌是一种机会性真菌病原体，通常感染免疫功能不全患者[7]。肺曲霉病如果治疗处理不当，会引发系统性曲霉病，死亡率可高达66.6%～80%[8]。临床上多见于血液病化疗后、肿瘤晚期或结核等以细胞免疫抑制为主的患者。疾病发生时宿主免疫功能状态常常出现紊乱和低下[9]。

人甘露聚糖结合凝集素 (MBL)在巨噬细胞吞噬病原体过程中起重要作用，作为机体固有免疫中具有多重功能的模式识别分子，不仅仅参与机体的天然免疫防御，而且在天然免疫与获得性免疫之间的相互作用中亦发挥作用[1]。它能够通过MBL糖识别区识别很多病毒/真菌/细菌等，当病原体的糖识别区与MBL的糖识别区结合后，MBL的胶原区就会跟巨噬细胞表面上的胶凝集素受体结合，发挥吞噬细胞对病原体的吞噬和杀灭作用。肺曲霉病中MBL不仅与疾病的易感性有关,而且与疾病的严重程度和预后有关[10]。国外通过MBL基因敲除大鼠实验研究发现敲除MBL基因更易感染侵袭性曲霉病[11]。在严重的CPA或病情严重的肺曲霉病患者中血清MBL水平明显升高[12]。本研究结果也表明，肺曲霉病急性期血清MBL的表达高于对照组，提示MBL参与肺曲霉的炎症反应。先天免疫、获得性免疫与细胞免疫功能状态至关重要。天然免疫是由多种识别及效应分子组成的复杂的网络结构,通过模式识别受体识别病原相关分子模式构成机体抗感染的第一道防线；通过抗原提呈、提供共刺激信号和调节细胞因子的分泌,启动获得性免疫应答并指导其应答的性质和强度。

研究发现T淋巴细胞在曲霉获得性免疫中起非常重要作用[3-4]。CD4细胞在曲霉感染中起到识别、趋化作用，是机体抵御真菌感染的关键因素[13]。CD4+T淋巴细胞协调B细胞分化产生抗体，主要介导细胞免疫应答,可以增强吞噬细胞功能,增加机体对曲霉的抵抗力。CD8+T淋巴细胞则抑制抗体的合成、分泌及T细胞的增殖，其释放细胞因子的产生与宿主曲霉感染的进展和恶化有一定关系，两者比例的稳态维持着机体正常的免疫应答[14]。随着机体免疫力水平的下降，CD3+CD4+/CD3+CD8+T淋巴细胞比值水平下降。本研究结果显示肺曲霉病组与同期健康对照组比较CD3+CD4+T淋巴细胞百分比及CD3+CD4+/CD3+CD8+T细胞比值水平均降低，说明肺曲霉病患者细胞免疫水平在真菌感染时是偏低的，推测是真菌感染的宿主易感因素。T淋巴细胞介导的免疫在抗曲霉感染中起重要作用，不同类型的Th细胞反应导致宿主对曲霉抵抗或易感的不同结局。Hebart[15]在其研究中证实了感染肺曲霉的小鼠中T细胞的免疫反应，Th1细胞因子干扰素-γ帮助实验小鼠抵抗烟曲霉感染，而Th2细胞因子IL-5和IL-13则参与了疾病的进展[16]。因此对曲霉感染中T淋巴细胞免疫始动和调节的深入研究将有助于发展新的抗曲霉治疗措施[17]。

烟曲霉刺激机体产生MBL进而启动天然免疫[18]，目前研究证实MBL具有识别曲霉表面的甘露聚糖、乙酰葡萄糖等外源性糖结构而不与哺乳类细胞上的内源性糖类结合。通过相关丝氨酸蛋白激酶触发一种蛋白酶级联反应激活补体途径，另外可以通过微生物表面补体组分如C3b的沉积作用启动调理性真菌识别、具有免疫调理活性[3-4]。目前国际上对MBL与获得性免疫的关系尚未明确报道，其免疫调节作用的研究较少。Downing等[19]发现，MBL可与B淋巴细胞结合，MBL作为急性期反应蛋白,在炎症发生时可在血管外与自身细胞结合,参与抗炎反应。Fraser等[20]报道，MBL可抑制细菌脂多糖刺激的Mo分泌IL-l而促进其产生IL-10、IL-6。应激状态下血液及局部组织MBL浓度增加，不仅可以发挥天然免疫作用，而且可以结合自身淋巴细胞，进而调控获得性免疫应答的发生和发展。

本研究证实了肺曲霉患者病过程中MBL与T淋巴细胞关系密切，因此继续探讨MBL在肺曲霉病中对免疫应答的指导作用特别是分子机制的研究，将对肺曲霉病发病机制的研究起重要作用。

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