试剂盒制备胸腹水细胞蜡块的应用体会

高丽丽，苏红丹，刘 华，李 青

细胞学标本处理技术多种多样。细胞涂片是最早和最简单的技术，液基细胞学检查始于20世纪90年代[1]，现已广泛应用，并实现半自动化和标准化。细胞蜡块是另一种常用的细胞学技术，自1999年被Kathleen等[2]报道以来，目前已有多种细胞蜡块制作技术[3]，但该领域还未形成明确的标准。与组织学标本类似，细胞蜡块保留了一些组织结构，并可进行多次切片。细胞蜡块技术较大程度上与其他医学领域的模式转变相吻合。首先，临床出现更多的微创手术，包括内镜下超声引导和支气管内超声引导下的穿刺样本。其次，依赖个性化药物需要通过辅助研究来确定的诊断，包括免疫组化染色和分子检测，一些研究报道均肯定了细胞蜡块技术应用的辅助诊断价值。另一些研究报道也提出了其不理想结果[4-8]。日常工作中，技术人员操作不当或非标准化的实验流程，均会影响细胞蜡块的质量和细胞特性从而影响诊断结果。本实验使用试剂盒制备细胞蜡块，操作简单、流程标准化，现介绍如下。

1 材料与方法

1.1 材料收集2020年4～8月上海市浦东新区人民医院病理科存档的胸腹水脱落细胞样本40例。

1.2 试剂试剂盒(图1)购自昆明东环科技公司：(1)专用离心管(基质)；(2)细胞固定液；(3)红细胞裂解液；(4)配套使用设备：干式恒温器。关键组成成分——专用离心管，由离心管和2个离心管盖构成，离心管为两端开口的圆柱形中空管，管内装有基质，离心管有两种规格：内径8 mm和4 mm(可用于处理微量细胞)。制备原理：将细胞混悬液加入含有基质的离心管，通过离心将细胞富集到一个平面上，最后将凝固后带有细胞层的基质取出并切下细胞块。分离后的细胞有序排列，肿瘤细胞、细胞团位于最下层，首先被切割成细胞块。

图1 细胞蜡块制备试剂盒：A.试剂和离心管；B.配套设备干式恒温器

1.3 方法(1)细胞收集：临床采集到的细胞学标本，经1 500 r/min离心5 min沉淀细胞，吸去上清液。(2)红细胞裂解：向细胞沉淀中加入5倍以上体积的红细胞裂解工作液(储存液与蒸馏水按1 ∶9配制)，轻轻混匀后放置5 min，然后，1 500 r/min离心5 min沉淀细胞，吸去红色的上清液。(3)细胞固定：向沉淀细胞中加入细胞体积5倍以上的细胞固定液，用吸管将细胞沉淀轻轻吹打成分散的细胞或细胞团，并预固定10 min。液基保存细胞无需进行再固定。(4)基质熔化：将专用离心管置于金属浴上，85 ℃加热15 min以上，使基质完全液化。(5)加样混匀：取出专用离心管，将预固定的细胞固定混匀液加入离心管中，用吸管反复抽吸使细胞混悬液和基质充分混匀。(6)离心：趁热立即离心，1 500 r/min离心5 min。(7)凝固基质：离心后，将置于4 ℃冰箱冷却10 min以后又经室温放置20 min，使基质充分凝固。(8)取材：拧开两端离心管盖，撕去密封膜，用棉签将含有细胞的基质端推出离心管，用刀片切下3 mm厚的细胞端，最下层细胞向下放入包埋盒中，进行常规脱水、包埋、切片、HE和免疫组化染色。

2 结果

2.1 细胞蜡块本组40例样本均成功制作成细胞蜡块。本方法制得的蜡块细胞量充分，切面形状规则，可连续切片和长期保存。

2.2 HE染色细胞量丰富，染色清晰，细胞红蓝对比鲜明，易于阅片(图2A)。

2.3 免疫组化染色阳性定位准确，强度适宜，背景干净(图2B、C)。

3 讨论

目前对于制备细胞蜡块的标准尚无共识，一些实验室对其细胞块的质量不完全满意。组织学标本的处理是直接放入包埋盒中，细胞学标本不适用该方法。细胞学标本需要离心，丢弃上清液后的沉淀物很难从离心管的底部吸取出来，而且易破碎。为解决这个问题，有实验使用“乙醇-吸管”法[9]，用吸管轻轻吸取细胞沉淀，但是离心后需经30 min乙醇固定，增加了实验时间。另有实验应用组织凝胶法[10]和液体胶法[11]，组织凝胶由琼脂糖组成，加热时液化，冷却时凝固，但操作步骤较繁琐；液体胶法是用液体胶将离心后的细胞沉淀物粘连。以上方法在概念上均较简单——离心、去除上清液、添加胶粘剂，但细胞蜡块的质量取决于技术员的经验。

使用试剂盒制备细胞蜡块解决了以上问题，除了增加细胞量，最重要的是操作简单，流程标准化。细胞数量的增加是由于在封闭的样品“腔”中捕获和保留细胞的能力，这减少了在多次转移/处理过程中标本的损失(如离心管、组织包埋盒)。试剂盒内包含专用离心管，具有预定的规格，包括4 mm(每管0.4 mL)和8 mm(每管1.2 mL)，可以根据细胞量选择合适的离心管。离心管上下均有管盖，可直接拧开下端管盖取出细胞沉淀，减少细胞的损失量。离心管直接放入配套的金属浴装置中，无需配制琼脂糖溶液。因此，使用试剂盒可减少对技术员操作技能的依赖，流程简单，易掌握。

试剂盒制备细胞蜡块需注意：(1)离心管内基质加热凝固后第2天再加热对基质的性质无影响；(2)配制好的红细胞裂解液(工作液)，在密闭容器中可使用3个月；(3)切下的细胞块要将最下层细胞(含有病变细胞)向下放入包埋盒，包埋时最下层细胞也要向下。

本实验绝大多数样本为液体，非细针穿刺标本。后续实验需要扩大到包括各种标本类型。目前，常用细胞蜡块制备技术的有用性和改进的必要性得到了充分认识。细胞蜡块处理需要改进和标准化，我们相信试剂盒制备细胞蜡块提供了潜在的选择。