左西孟旦拮抗庆大霉素致豚鼠耳蜗毛细胞损伤的研究

卢宇涵 徐青文 陈琳 孙潘威 张婷 赵乌兰

耳毒性药物作为造成听力损害的原因之一，已在临床上得到高度重视。庆大霉素作为等氨基糖苷类抗生素的代表性药物，通过在内耳淋巴液中浓度积累对耳蜗毛细胞和前庭毛细胞可造成不可逆的损伤，常常表现为延迟性、渐进性听力下降、平衡障碍和耳鸣[1]。有研究表明这些损伤有可能是因为庆大霉素在淋巴液集聚后，对Corti's器内的毛细胞、支持细胞等结构造成损伤[2]，目前其损伤机制有钙超载、氧自由基过量等。左西孟旦作为II型钙增敏剂，不仅具有良好的抗细胞凋亡、抗氧自由基作用，还可不增加细胞内钙离子浓度、不引起钙超载。因此，本研究从庆大霉素对耳蜗毛细胞的损伤机制，探究和阐释左西孟旦通过抗凋亡、抗氧自由基作用保护内耳形态和功能的作用机制，为临床所有药物防治耳毒性药物相关听力损伤提供新的实验依据和理论基础。

1 材料与方法

1.1 动物分组及给药方法

由浙江中医药大学动物实验中心提供健康级DHP白化红目白毛雌性豚鼠60只，体重300～330 g，合格证书：SCXK（沪）20130016。所有动物均通过preyer反射，无耳部疾病，查体无异常。实验动物随机分为6组：庆大霉素损伤组GM(gentamicin modelgroup)组，100 mg.kg-1.d-1,肌肉注射硫酸庆大霉素注射液，川芎嗪阳性对照组TMG(ligustrazine treatmentgroup)组，100 mg.kg-1.d-1肌肉注射硫酸庆大霉素注射液+10 mg.kg-1.d-1腹腔注射盐酸川芎嗪注射液联合给药，羟丙基-β-环糊精辅料对照组CD(hydroxyproplyl-β-cyclodextrin shamgroup)组，100 mg.kg-1.d-1肌肉注射硫酸庆大霉素注射液+350 mg.kg-1.d-1静脉注射羟丙基-β-环糊精注射液联合给药，低剂量左西孟旦组LL(low dose of levosim endan tream entgroup)组，100 mg.kg-1.d-1肌肉注射硫酸庆大霉素注射液+1.5 mg.kg-1.d-1静脉注射左西孟旦注射液联合给药，高剂量左西孟旦组HL(high dose of levosim endan treamentgroup)组，100 mg.kg-1.d-1肌肉注射硫酸庆大霉素注射液+2.5 mg.kg-1.d-1静脉注射左西孟旦注射液联合给药）和正常对照组，联合给药时前后均存在30 min给药间隔，造模连续用药12 d。

1.2 药品及试剂

硫酸庆大霉素注射液购自浙江瑞新药业股份有限公司，批号20150505；注射用盐酸川芎嗪注射液购自哈尔滨三联药业有限公司，批号150104D2；左西孟旦原料药购自湖北武汉大华伟业医药（化工）集团，批号2016011；羟丙基-β-环糊精购自西安德立化工有限公司，批号20150114。左西孟旦针剂配制方法按照中国人民共和国国家知识产权局专利《左西孟旦制剂及其制备方法》（专利号ZL03112427.5）实施例4标准配制，左西孟旦与羟丙基-β-环糊精摩尔比为1:30，针剂配制均严格遵照无菌要求。

1.3 主要仪器

听性脑干诱发仪（ICS CHARTR RP 200,丹麦Madsen公司）；HM340E石蜡切片机（德国MICROM公司）；DMLB2型显微镜摄像机（德国LEICA公司）；GNP-9080型隔水式恒温培养箱（中国上海精宏医疗设备有限公司）；DHG-9140A型电热恒温干燥箱（中国上海精宏医疗设备有限公司）；HI120型摊片机（德国Leica公司）。

1.4 听性脑干诱发电位测试

ABR测试采用丹麦Madsen听性脑干诱发仪CHARTR EP测试系统。实验动物行1%戊巴比妥钠30 mg•kg-1腹腔注射麻醉后，俯卧于保温毯上。两耳廓前沿连线中点颅顶为记录电极入针点，参考电极插入外耳廓后软组织内，地极插入鼻尖处，在标准隔声室内用短声click声刺激，参数设置：采样重复率为11.1次/秒，分析时程扫描周期为20 ms，带通滤波为100～3000 Hz，信号叠加512次。起始声刺激为90 dB nHL引出后逐步降低幅值10 dB直至无法引出可以重复的ABR波形，重复后仍未引出后以幅值5 dB提高刺激强度，以刚出II波和/或III波的刺激强度来确定ABR客观听力阈值。ABR测试行毕后立即断头取耳蜗，行常规形态学检测。

1.5 石蜡切片的HE染色

耳蜗组织外固定后行常规石蜡切片，二甲苯脱蜡10分×2次，无水乙醇3分×2次、95%乙醇2分×2次、80%乙醇2分×1次、70%乙醇2分×1次、至自然水化，Gill苏木素染色液10分钟，自然水洗2分，镜下观察时用0.5%盐酸乙醇分化数秒，流水冲洗、温水蓝化，95%乙醇1分钟，0.5%伊红乙醇染色液染色1分钟，80%乙醇适当分化，95%乙醇脱水3分钟×2次，100%乙醇脱水3分钟×2次，二甲苯透明5分钟×2次、中性树胶封片，普通光学显微镜下观察切片并拍照。

1.6 免疫组化染色法

采用丹麦DAKO公司EnVisionTM二步法。石蜡切片后二甲苯脱蜡，采用高温高压法修复（0.01 M枸橼酸钠缓冲溶液PH 6.0），3%H2O2溶液阻断内源性过氧化物酶，滴加按比例稀释的一抗孵育（CaV1.3为兔抗鼠多抗，工作浓度1:60，美国Gene Tex公司，编号GT16633；Capase-3为兔抗鼠多抗，工作浓度1:200，美国CST公司，编号#9662），用磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer solution,PBS)代替一抗为空白对照。PBS冲洗后滴加二抗（羊抗兔IgG-HRP），二氨基联苯氨（diaminobenzidine,DAB)显色；Harris苏木素液复染细胞核，乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.7 阳性结果判断和定量分析

免疫组织化学阳性为黄色或黄棕色，细胞核衬染呈蓝色。采用图像分析系统测量，在显微镜（×200）下选择确定毛细胞区域并拍照。使用Image-ProPlus 5.0图像分析软件测定任意5个视野内阳性毛细胞的平均光密度（mean density），取平均值代表该标本的染色强度。

1.8 统计学方法

使用SPSS 23.0软件对所有数据进行方差分析处理，以均数±标准差（±s）表示。数据使用方差分析均数两两比较法，若满足方差齐性，使用LSD法比较组间差异；若不满足方差齐性，则用Wlech法矫正后用Dunnett’s T3法比较组间差异，以P＜0.05为具有统计学差异的检验标准。

2 结果

2.1 听性脑干诱发电位

ABR测试分别对各组豚鼠双耳进行听力阈值测试。在造模期间出现的豚鼠由于静脉给药、庆大霉素毒副作用等死亡现象[3]及实验中ABR未引出（CG组3耳、TMG组4耳、LL组3耳、HL组3耳、CD组2耳），均排除在纳入数据外。且为保证实验条件一致，未进行豚鼠数量的补充。模型组庆大霉素组与实验组相比，其听力阈值高于左西孟旦保护组和川芎嗪阳性对照组，组间均具有显著性差异（P=0.000＜0.01，P=0.002＜0.01）。正常组与庆大霉素组相比，正常组豚鼠ABR听阈低于庆大霉素组，组间具有统计学差异（P＜0.05）；而与左西孟旦组和川芎嗪阳性对照组豚鼠与正常组豚鼠相比则无统计学差异（P＞0.05）（见表1）。

2.2 HE染色结果

庆大霉素组耳蜗毛细胞崩解，细胞核散在缺失，血管纹变薄，小血管萎缩（图1-A），羟丙基-β-环糊精辅料对照组与其一致。正常组可明显见耳蜗Corti’s器毛细胞排列整齐，结构完整且无损伤，并可见清晰血管纹，胞核明显（图1-F），而左西孟旦组和川芎嗪阳性对照组可见均毛细胞形态出现不同程度的损伤，其中高剂量左西孟旦组毛细胞排列整齐，胞核明显（图1-B），而低剂量左西孟旦组和川芎嗪组出现少许缺失，血管纹部分细胞胞核散在缺失（图1-C/D）。

2.3 Capase-3和CaV1.3蛋白表达情况

组间分析后发现Caspase-3和CaV1.3蛋白表达量具有统计学差异（P＜0.01，F=3.449；P＜0.01，F=7.824）。组内分析后发现，庆大霉素组耳蜗Caspase-3蛋白表达量与低剂量左西孟旦保护组相比明显升高（图2-b/c），具有统计学差异（P＜0.01）；而庆大霉素组豚鼠CaV1.3蛋白表达量降低，与低剂量左西孟旦组豚鼠比较有显著差异（P＜0.01），与其余组无差异（见表2）。其中可见庆大霉素组豚鼠耳蜗Corti’s器褐染，外毛细胞崩坏，细胞核缺失，呈空泡样变；正常组和左西孟旦组则可见毛细胞结构正常（图2-a/c）。

3 讨论

耳毒性药物所导致的感音神经性聋是临床上预防和治疗的难题，以氨基糖苷类抗生素为代表的耳毒性药物具有广谱抗菌、抑菌作用、价格低廉等诸多临床优点，且在应对一些特殊感染、结核病[4]、艾滋病[5]的治疗有新疗效，但因氨基糖苷类抗生素长期用药伴随严重的肾毒性和耳毒性副作用限制了其临床应用。近年来多项研究表明，使用有效的药物可以缓解氨基糖苷类抗生素所导致毒副作用[6～8]。左西孟旦作为一种新型的钙增敏剂，通过与心肌细胞上肌钙蛋白C（TnC）结合促进心肌收缩，并激活ATP敏感钾离子通道，发挥血管舒张作用和轻度磷酸二脂酶抑制效应。

表1 各组豚鼠听性脑干诱发电位听力阈值表（±s, n=74）

表1 各组豚鼠听性脑干诱发电位听力阈值表（±s, n=74）

注：与NC相比，**P＜0.01；与GM组相比，*P＜0.05，△P＜0.01

组别 耳数（n） 听性脑干诱发电位阈值（dB nHL）羟丙基-β环糊精组 6 55.0±21.0*庆大霉素组 9 51.7±15.2**川芎嗪阳性对照组 16 22.8±16.6△高剂量左西孟旦 13 26.5±14.8△低剂量左西孟旦 13 29.2±10.6△正常组 17 11.2±14.2

表2 组间豚鼠耳蜗毛细胞Capase-3和CaV1.3平均光密度表达量统计表（±s,n=39）

表2 组间豚鼠耳蜗毛细胞Capase-3和CaV1.3平均光密度表达量统计表（±s,n=39）

注：与庆大霉素组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与正常组相比，□P＜0.05；与羟丙基-β-环糊精辅料对照组相比，△P＜0.05

组别 耳数（n） Capase-3 CaV1.3平均光密度值（AOD） 95%置信区间 平均光密度值（AOD） 95%置信区间羟丙基-β环糊精组 3 0.187±0.012 0.158-0.217 0.140±0.008 0.120-0.161庆大霉素组 12 0.184±0.014 0.175-0.192 0.194±0.023△ 0.179-0.209川芎嗪阳性对照组 9 0.197±0.011* 0.189-0.205 0.207±0.026 0.187-0.227高剂量左西孟旦 5 0.188±0.019□ 0.164-0.212 0.188±0.037□ 0.142-0.234低剂量左西孟旦 4 0.156±0.011**□ 0.139-0.173 0.137±0.010* 0.121-0.154正常组 6 0.177±0.025 0.150-0.203 0.172±0.018△ 0.153-0.191 F 3.449 7.824 P 0.008 0.000

图2 各组豚鼠Caspase-3染色结果（方底箭头：完整细胞；圆底箭头：受损细胞）

3.1 川芎嗪和左西孟旦对豚鼠的听力保护作用

本研究得出，给予庆大霉素的同时给予保护药物左西孟旦和川芎嗪可以显著地保护豚鼠的听力，其中川芎嗪对豚鼠听力保护效果最佳（阈移22.2 dB），高剂量左西孟旦其次（阈移18.5 dB），低剂量左西孟旦最差（阈移15.8 dB），但由于听性脑干诱发电位实验中以5 dB为步阶，对于三者药物组间构不成明显的差异，不具有功能性的意义。李威[6]研究得出椒苯酮胺（PPTA）对庆大霉素损伤下的豚鼠听力具有保护作用，用药后与庆大霉素损伤组相比ABR阈值降低。作为与PPTA同为II型钙增敏剂的左西孟旦，两者对豚鼠听力的保护效果一致，由于实验各项条件不同，PPTA和左西孟旦间对听力保护作用的差异不作讨论。

3.2 川芎嗪和左西孟旦对毛细胞Caspase-3表达的影响

Forge等[9]发现细胞凋亡是庆大霉素对耳蜗毛细胞损伤的主要途径，Blanchet等[10]研究发现庆大霉素通过破坏胆碱能受体上钙离子内流，阻滞耳蜗外毛细胞乙酰胆碱诱发的K+电位，增加细胞外钙离子浓度逆转，通过烟碱样受体抑制钙离子内流实现对K+电流的阻滞。ATP的消耗造成了ATP依赖钙通道功能障碍，造成细胞内钙超载[11]。细胞内大量的Ca2+作为凋亡刺激因子引起大量细胞色素C从线粒体膜间隙释放到胞浆中，与APaf-1结合，在dATP和ATP的介导下聚合为复合体[12]，这种复合体充分聚集门冬氨酸半胱氨酸蛋白酶，启动Capase-9自动活化，激活在细胞凋亡中起主要作用下游Caspase（Caspase-3）。本研究结果可见庆大霉素损伤组造模后Capase-3表达量明显增高，表明庆大霉素在长期用药过程中缓慢透过血-迷路屏障，在内耳淋巴液中缓慢聚集后对内耳毛细胞产生毒性作用，耳蜗外毛细胞均发生崩解破解、细胞核散在缺失，这与相关文献报道一致[6,11]。

给予高、低剂量左西孟旦和川芎嗪后，显著地发现低剂量左西孟旦组豚鼠毛细胞Caspase-3表达量下调，与庆大霉素损伤组呈显著性差异，而高剂量左西孟旦组较庆大霉素组略低，无统计学差异，这可能是因为高浓度长期给药，对豚鼠具有一定的药物毒副作用。同时在造模过程中可以明显观察到高剂量左西孟旦组豚鼠在同期与低剂量左西孟旦组的对比中发现，毛色、清洁度、活动度均下降。而川芎嗪组豚鼠Caspase-3高于庆大霉素组，说明本实验中川芎嗪对Caspase-3的表达无下调的作用。

3.3 川芎嗪和左西孟旦对毛细胞CaV1.3表达的影响

钙离子通道蛋白CaV1.3作为L型电压门控离子通道，对组织、细胞的兴奋性及钙离子信号传导具有重要的作用[13]。有研究表明，新生的内耳毛细胞敲除了CaV1.3蛋白后，听力立即丧失，由此可见CaV1.3蛋白在内耳听觉功能的重要性[14]。这种联系可能是因为氨基糖苷类抗生素引起细胞内钙超载，细胞内钙离子浓度的升高使钙离子通道拮抗剂部分抵消[15]本课题组前期研究应用川芎嗪拮抗GM耳毒性作用中发现，尽管庆大霉素损伤组Caspase表达量明显升高，提示细胞大量凋亡，但CaV1.3表达量较正常对照组及阳性药物对照组相比有所减少且低于正常值，该结果与本研究及同类相关研究结果一致[15]。这可能是因为庆大霉素损伤组经给药后庆大霉素在内耳淋巴液中聚集使得细胞裂解，细胞膜上钙离子通道蛋白降解，而川芎嗪保护组延缓了凋亡的进程，但仍无法阻止钙离子大量涌入细胞内。而低剂量左西孟旦保护组毛细胞CaV1.3表达量未见升高，且Caspase表达未见异常，这揭示了左西孟旦对庆大霉素损伤下有效的抗凋亡和抗钙超载作用。但是，本实验仍存在一定局限性，如未对豚鼠纳入时进行实验前的ABR测试，对豚鼠死亡现象未跟踪原因等。后续实验对于在不同浓度庆大霉素对耳蜗毛细胞损害作用下细胞膜CaV1.3蛋白的变化及调节机制和左西孟旦药物保护下其变化和调节机制还有待研究。

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