疏风止咳提取物质量标准研究

武琳 杨光

摘要：目的 建立疏風止咳提取物的质量标准，提高其质量可控性，保证成品药效。方法 采用HPLC同时对疏风止咳提取物中白芍、防风、虎杖、甘草、射干和北柴胡进行专属性鉴别，色谱柱为Phenomenex Kintex C18（4.6 mm×100 mm，2.6 ?m），流动相为乙腈-0.05%磷酸，梯度洗脱（0～25 min，10%乙腈；25～26 min，10%→14%乙腈；26～35 min，14%乙腈；35～36 min，14%→34%乙腈；36～55 min，34%乙腈），柱温40 ℃，流速0.8 mL/min，检测波长250 nm。采用HPLC同时测定疏风止咳提取物中芍药苷和升麻素苷含量。色谱柱为Phenomenex Luna C18（4.6 mm×150 mm，5 ?m），流动相为乙腈-0.05%磷酸（12∶88），柱温40 ℃，流速1 mL/min，检测波长250 nm。结果 疏风止咳提取物中白芍、防风、虎杖、甘草、射干和北柴胡HPLC色谱峰分离度好且阴性无干扰。芍药苷在0.035 93～2.514 8 ?g范围内线性关系良好（r=0.999 5），平均加样回收率为100.54%（n=6）；升麻素苷在0.006 7～0.67 ?g范围内线性关系良好（r=0.999 5），平均加样回收率为100.39%（n=6）。结论 本研究建立的质量标准简便、可靠、准确，可快速鉴别疏风止咳提取物中白芍、防风、虎杖、甘草、射干和北柴胡，快速测定芍药苷和升麻素苷含量，为控制疏风止咳提取物的质量提供依据。

关键词：疏风止咳提取物；高效液相色谱法；芍药苷；升麻素苷

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.03.020

中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）03-0082-05

Study on Quality Standards for Shufeng Zhike Extract WU Lin， YANG Guang （Beijing Zhongyan Tongrentang Chinese Medicine R&D; Co. LTD.， Beijing 100075， China）

Abstract： Objective To establish the quality standards for Shufeng Zhike Extract； To improve the controll ability of the extract and ensure medicine efficacy. Methods To establish a HPLC method for simultaneous differentiation of Paeoniae Radix Alba， Saposhnikoviae Radix， Polygoni Cuspidati Rhizomaet Radix， Glycyrrhizae Radix et Rhizoma， Belamcandae Rhizoma and Bupleurum in Shufeng Zhike Extract. Phenomenex Kintex C18 column （4.6 mm×100 mm， 2.6 ?m） was used. Acetonitrile-0.05% phosphoric acid was as the mobile phase in gradient elution （0–25 min， 10% acetonitrile； 25–26 min， 10%→14% acetonitrile； 26–35 min， 14% acetonitrile； 35–36 min， 14%→34% acetonitrile； 36–55 min， 34% acetonitrile） at flow rate of 0.8 mL/min， and column temperature was 40 ℃. The detection wavelength was 250 nm. To establish a HPLC method for simultaneous determination of Paeoniflorin and Prim-O-glucosylcimifugin in Shufeng Zhike Extract， Phenomenex Luna C18 column （4.6 mm×150 mm， 5 ?m） was used； acetonitrile-0.05% phosphoric acid （12：88） was as the mobile phase at flow rate of 1 mL/min； column temperature was 40 ℃； the detection wavelength was 250 nm. Results The chromatographic peak separation with HPLC method for simultaneous differentiate of Paeoniae Radix Alba， Saposhnikoviae Radix， Polygoni Cuspidati Rhizoma et Radix， Glycyrrhizae Radix et Rhizoma， Belamcandae Rhizoma and Bupleurumin in Shufeng Zhike Extract was clear and negative control had no interference. The linear range of Paeoniflorin was 0.035 93–2.514 8 ?g （r=0.999 5）， and the average recovery was 100.54% （n=6）. The linear range of Prim-O-glucosylcimifugin was 0.006 7–0.67 ?g （r=0.999 5）， and the average recovery was 100.39% （n=6）. Conclusion The established quality standards are simple， reliable， and accurate. It can rapidly identificate Paeoniae Radix Alba， Saposhnikoviae Radix， Polygoni Cuspidati Rhizomaet Radix， Glycyrrhizae Radix et Rhizoma， Belamcandae Rhizoma and Bupleurum， and suitable for rapid determination of Paeoniflorin and Prim-O-glucosylcimifugin， which can provide the basis for the quality inspection of Shufeng Zhike Extract.

Key words： Shufeng Zhike Extract； HPLC； Paeoniflorin； Prim-O-glucosylcimifugin

通讯作者：杨光，E-mail：y2000g@263.net

疏风止咳颗粒为北京中研同仁堂医药研发有限公司研发的中药六类复方新药，其功能主治为疏风宣肺、止咳化痰、解痉平喘。疏风止咳颗粒由白芍、防风、柴胡、射干、虎杖、甘草及苦杏仁等12味药组成，其提取物的制法为以上12味药加水煎煮2次，合并滤液，过滤，浓缩，制成干膏粉。在以往的文献资料中，关于单味药材提取物的质量标准研究较多，而复方制剂提取物的质量标准研究较少。本研究注重复方制剂提取物的质量标准研究，建立HPLC同时对疏风止咳提取物中白芍、防风、虎杖、甘草、射干和北柴胡药材的专属性鉴别方法，及HPLC同时测定疏风止咳提取物中芍药苷和升麻素苷含量的方法，为控制该提取物的质量提供依据，同时为工艺条件筛选提供可靠准确的数据支持，以保证药物疗效。

1 仪器与试药

Agilent 1100高效液相色谱仪（DAD二极管阵列检测器），METTLER TOLEDO XP205型电子分析天平（梅特勒-托利多国际股份有限公司），KQ-250DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，功率250 W，频率40 kHz）。

虎杖苷对照品（供含量测定用，批号111575- 200301）、甘草苷对照品（供含量测定用，批号111610- 201106，含量以93.7%计）、射干苷对照品（供含量测定用，批号111632-200501）、甘草酸铵对照品（供含量测定用，批号110731-201116，含量以93.1%计）、芍药苷对照品（供含量测定用，批號110736-200934，含量以95.7%计）、升麻素苷对照品（供含量测定用，批号1522-200203），中国食品药品检定研究院；柴胡皂苷B2对照品（供含量测定用，批号ES-110928，纯度≥98%），上海亿欣生物技术有限公司；疏风止咳提取物，北京中研同仁堂医药研发有限公司提供（批号20120331、sf01、sf02、sf03、sf04、sf05、sf06、sf07、sf08、sf09）；配制标准溶液及供试品溶液的试剂均为分析纯，液相色谱用试剂为高效液相级，液相用水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 高效液相色谱鉴别

2.1.1 色谱条件 色谱柱：Phenomenex Kintex C18（4.6 mm×100 mm，2.6 ?m）；流动相A为乙腈，B为0.05%磷酸，梯度洗脱程序见表1；流速0.8 mL/min；检测波长250 nm；柱温40 ℃。理论板数按芍药苷峰和升麻素苷峰计算分别应不低于2500。

表1 流动相梯度洗脱条件（%）

时间 A B

0～25 min 10 90

25～26 min 10→14 90→86

26～35 min 14 86

35～36 min 14→34 86→66

36～54.5 min 34 66

54.5～55 min 34→10 66→90

55～60 min 10 90

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取芍药苷对照品、升麻素苷对照品、虎杖苷对照品、甘草苷对照品、射干苷对照品、甘草酸铵对照品、柴胡皂苷B2对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含芍药苷150 ?g、升麻素苷30 ?g、虎杖苷130 ?g、甘草苷30 ?g、射干苷25 ?g、甘草酸铵30 ?g和柴胡皂苷B2 25 ?g的混合溶液，作为对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备 取本品1 g，研细，置具塞锥形瓶中，加入甲醇25 mL，密塞，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）40 min，放冷，摇匀，过滤，取续滤液，作为供试品溶液。

2.1.4 阴性对照溶液的制备 按处方比例分别取不含白芍、防风、虎杖、甘草、射干和柴胡的其余饮片，按其工艺制成空白制剂，按“2.1.3”项下方法制备，即得。

2.1.5 空白干扰试验 精密吸取供试品溶液，芍药苷、升麻素苷、虎杖苷、甘草苷、射干苷、甘草酸铵、柴胡皂苷B2的混合对照品溶液，白芍阴性对照溶液，防风阴性对照溶液，虎杖阴性对照溶液，甘草阴性对照溶液，射干阴性对照溶液和柴胡阴性对照溶液各5 ?L，在“2.1.1”项色谱条件下进样，记录色谱图。结果在供试品色谱中呈现与对照品芍药苷、升麻素苷、虎杖苷、甘草苷、射干苷、甘草酸铵、柴胡皂苷B2色谱峰保留时间相同的色谱峰。白芍阴性对照溶液在与芍药苷对照品相同保留时间处未显色谱峰，防风阴性对照溶液在与升麻素苷对照品相同保留时间处未显色谱峰，虎杖阴性对照溶液在与虎杖苷对照品相同保留时间处未显色谱峰，甘草阴性对照溶液在与甘草苷和甘草酸铵对照品相同保留时间处未显色谱峰，射干阴性对照溶液在与射干苷对照品相同保留时间处未显色谱峰，柴胡阴性对照溶液在与柴胡皂苷B2对照品相同保留时间处未显色谱峰，故认为空白无干扰。色谱图见图1。

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Phenomenex Luna C18（4.6 mm×150 mm，5 ?m）；流动相：乙腈-0.05%磷酸（12∶88）；流速：1 mL/min；检测波长：250 nm；柱温：40 ℃。理论板数按芍药苷峰和升麻素苷峰计算分别应不低于2500。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取芍药苷对照品和升麻素苷对照品适量，加甲醇制成每1 mL分别含0.15 mg和30 ?g的混合溶液，即得。

2.2.3 供试品溶液的制备 取本品适量，研成细粉，取约1 g，精密称定，置50 mL量瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定质量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）40 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

2.2.4 阴性对照溶液的制备 按处方比例分别取不含炒白芍药材和防风药材的其余药材，按其工艺制成空白制剂，按“2.2.3”项下方法制备，即得。

2.2.5 空白干扰试验 精密吸取供试品溶液、芍药苷和升麻素苷混合对照品溶液、炒白芍阴性对照溶液和防风阴性对照溶液各5 ?L，在上述色谱条件下进样，记录色谱图。结果芍药苷和升麻素苷可与其他成分基线分离，炒白芍阴性对照溶液在与芍药苷对照品相同保留时间处未显色谱峰，防风阴性对照溶液在与升麻素苷对照品相同保留时间处未显色谱峰，故认为空白无干扰。色谱图见图2。

2.2.6 线性关系考察 分别精密吸取芍药苷对照品溶液（0.375 4 mg/mL，含量以95.7%计）0.1、0.2、0.3、0.5、1、3、5、6、7 ?L注入液相色谱仪，测得峰面积，以对照品进样量（?g）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，结果表明芍药苷在0.035 93～2.514 8 ?g范围内进样量与峰面积呈良好的线性关系。回归方程为Y=309.5X+3.991，r=0.999 5，可用外标一点法计算。

分别精密吸取升麻素苷对照品溶液（0.134 mg/mL）0.05、0.2、0.3、0.4、0.5、2、3、5 ?L注入液相色谱仪，测得峰面积。以对照品进样量（?g）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，结果表明升麻素苷在0.006 7～0.67 ?g范围内进样量与峰面积呈良好的线性关系。回归方程为Y=1854X+2.723，r=0.999 5，可用外标一点法计算。

2.2.7 精密度试验 精密吸取同一供试品溶液，连续进样6次测定。芍药苷含量平均值为4.086 5 mg/g，RSD=0.48%；升麻素苷含量平均值为0.415 5 mg/g，RSD=1.71%。表明精密度良好。

2.2.8 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、10、12、24 h进样测定。芍藥苷含量平均值为4.130 3 mg/g，RSD=1.01%；升麻素苷含量平均值为0.410 7 mg/g，RSD=1.77%。表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.2.9 重复性试验 精密称取同一批疏风止咳提取物样品（批号20120331）6份，分别按“2.2.3”项下方法制成供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定。芍药苷含量平均值为4.254 2 mg/g，RSD=1.79%；升麻素苷含量平均值为0.414 4 mg/g，RSD=0.91%。表明本方法重复性良好。

2.2.10 加样回收率试验 精密称取已知含量的供试品（批号20120331，含芍药苷4.254 2 mg/g、升麻素苷0.414 4 mg/g）6份，每份约0.5 g，分别精密加入芍药苷对照品（0.087 8 mg/mL，含量以95.7%计）和升麻素苷对照品（8.04 ?g/mL）混合溶液25 mL，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定。结果芍药苷平均回收率为100.54%（n=6），RSD=2.83%；升麻素苷平均回收率为100.39%（n=6），RSD=2.69%。见表2、表3。

2.2.11 样品含量测定 取10批疏风止咳提取物，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，每批样品测定3次，结果见表4。

3 讨论

本研究曾分别建立疏风止咳提取物中虎杖苷、射干苷、柴胡皂苷B2的含量测定方法，疏风止咳提取物的HPLC鉴别方法是在虎杖苷、射干苷、柴胡皂苷B2含量测定方法的基础上建立的。通过考察检测波长207、220、237、250、254 nm条件下的色谱图，结果发现波长为250 nm时，样品中各被检测的峰响应值适合，且阴性无干扰，故选择检测波长为250 nm。在试验中发现提高柱温后，被检测峰之间的分离度较好，同时可以改善峰型，故柱温选用40 ℃。

本研究实现了HPLC同时鉴别白芍、防风、虎杖、甘草、射干和北柴胡药材，为建立特征图谱或指纹图谱奠定了基础。该法与薄层色谱鉴别法相比，供试品制备操作简便，方法快速，有毒试剂用量少。

白芍中芍药苷和防风中升麻素苷的含量测定方法较多[1-4]，本研究选择HPLC。在建立该提取物芍药苷和升麻素苷含量测定方法时[5]，对流动相进行了选择，结果发现乙腈-0.05%磷酸（12∶88）作为流动相时所得芍药苷与升麻素苷分离度好，峰型好且阴性无干扰。不同批号疏风止咳提取物中芍药苷和升麻素苷含量相差较远，分析原因可能是不同批号炒白芍饮片和防风饮片中的芍药苷和升麻素苷含量差异所导致，提示生产中应控制炒白芍饮片和防风饮片中的芍药苷和升麻素苷含量。

本研究在试验中取芍药苷对照品加甲醇溶解，注入液相色谱仪，用二极管阵列检测器进行紫外全波长扫描（200～400 nm），结果芍药苷在230 nm附近有最大吸收峰，但供试品色谱图中，检测波长为230 nm时芍药苷峰处有干扰，查看干扰峰的全波长扫描图，发现干扰峰在250 nm处有最小吸收峰，故比较检测波长为230 nm和250 nm时干扰峰对芍药苷峰的影响，结果发现检测波长为250 nm时，供试品色谱图中芍药苷峰处无干扰，故选择检测波长为250 nm。

本研究建立了HPLC同时对疏风止咳提取物中白芍、防风、虎杖、甘草、射干和北柴胡药材的专属性鉴别方法，该法充分体现了专属性鉴别和多成分、整体质量控制的理念。建立的HPLC同时测定疏风止咳提取物中的芍药苷和升麻素苷含量的方法，操作简便，实用性强，重复性好，可快速准确测定疏风止咳提取物中芍药苷和升麻素苷的含量，可用于控制疏风止咳提取物的质量，为工艺条件筛选提供可靠的数据支持，以保证药物疗效。

参考文献：

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[2] 倪健，王晓强，任天池，等.茵莲清肝合剂中芍药苷的含量测定[J].北京中医药大学学报，2003，26（5）：67-69.

[3] 李小华，刘洁，李颖，等.HPLC测定消风止痒颗粒中的升麻素苷[J].华西药学杂志，2010，25（5）：610-611.

[4] 陈静，李正杰，张彦芬，等.HPLC法测定痛泄胶囊中升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、芍药苷含量[J].中医药信息，2011，28（4）：35-37.

[5] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社，2010：96-97.

（收稿日期：2016-01-07）

（修回日期：2016-07-04；编辑：陈静）