腰椎黄韧带肥厚与细胞凋亡关系的实验研究

阿力木江·阿西木，吐尔洪江·阿布都热西提，艾尔肯·阿木冬⋆

（新疆医科大学，新疆 乌鲁木齐 830054）

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取我院2014年6月～2014年12月收治的黄韧带肥厚引起腰椎管狭窄患者为和单纯腰椎间盘突出没有黄韧带肥厚患者的黄韧带。退变组为黄韧带肥厚的患者15个，年龄34～76岁。对照组为单纯椎间盘突出，但没有黄韧带肥厚的年轻人5个，年龄在16～20岁。

1.2 方法

（1）用Image-proplus 6.0软件做图片分析对比累积光密度（IOD，integrated optical density）总数。

（2）常规HE染色，显微镜下观察。

（3）免疫组织化学染色法：连续4微米切片，常规脱蜡至水→新鲜配置3%H2O2室温孵育l0 min→PBS（磷酸缓冲盐溶液）洗3次，每次3分钟后进行修复抗原（抗原修复均采用微波加热修复），将切片充分浸泡放入0.0lM的柠檬酸缓冲液中煮沸10分钟，取出后室温自然冷却，用PBS冲洗3次，加入一抗（TGF-β抗体），置于湿盒4℃冷箱中过夜后取出，在室温下平衡5分钟后，用PBS洗3次，每次3分钟，随后分别滴入生物素化的二抗（抗兔IgG和抗小鼠IgG），放置在37℃恒温箱中30分钟后取出，再次用PBS洗3次，每次3分钟，用DAB显色5至10分钟后通过光学显微镜观察，适当时机终止显色，用自来水冲洗，切片经过苏木素复染后依次通过75%、80%、95%、10%酒精脱水，用二甲苯透明3次，每次5分钟，最后用中性树胶封片。每例均设阴性对照—空白对照（PBS代替一抗）。

免疫组化结果判定：选择应用光学显微镜，并于免疫组织化学染色成功之后，对切片进行仔细的观察。在每个切片当中选择具有代表性的区域（共5个），于高倍显微镜视野之下对所选择的区域进行观察。各高倍镜视野计数100个细胞，并计算出阳性细胞数在总细胞数中所占的比例。取5个视野的算术平均值。利用双盲法对结果进行判定，并由2名专业的病理学家重复阅片，同时对免疫组化染色结果进行仔细的核定。视显色细胞的比例进行计分，若显色细胞不足10%，计0分；若显色细胞在10～20%，计1分；若显色细胞在21～50%，计2分；若显色细胞超过50%，计3分。从细胞染色的强度上进行计分，具体为：若细胞无显色，计0分；若细胞呈浅黄色，计1分；若细胞呈棕黄色，计2分；若细胞呈黄褐色，计3分。每例积分=显色细胞比例计分*细胞染色强度计分。最高9分，最低0分。若总分＜3分，提示阴性“—”；若总分在3-5分之间，提示阳性“+”；若总分≥6分，提示强阳性“++”。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件对数据进行分析，计量资料采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

大体病理学观察肥厚的黄韧带厚度均为5 mm，无光泽，脆性增加，部分发现钙化及骨化，与周围组织粘连明显，不易分离，切下后呈团状。正常腰椎黄韧带厚度小于4 mm，表面光泽、透亮、柔软，未发现钙化及骨化，和周围组织粘连不明显，易于分离，切下后回缩快，呈卷曲状。

用Image-proplus 6.0软件做图片分析对比累积光密度总数见对照组为2.4312422，退变组为2.6556708，两者有显著的差别。

黄韧带肥厚患者HE染色有纤维软骨变形，纤维排列紊乱，骨化及炎性细胞浸润表现，而没有黄韧带肥厚患者的黄韧带虽然有局部炎性改变外，没有钙化及骨化表现，纤维结构排列较整齐，二者差异显著。

黄韧带肥厚患者免疫组化表现为TGF-β表达阳性，染色呈黄色，细胞核消失，无正常结构，而黄韧带没有肥厚的TGF-β表达阴性，染色灰色，细胞核清楚可见，二者差异显著。

表1 两组成纤维细胞数的比较（±s）

表1 两组成纤维细胞数的比较（±s）

注：经卡方检验，x2=5.894，P=0.016

±s对照组 5 10.16±6.32退变组 15 61.36±15.29分组 nx

表2 两组TGF-β表达情况的比较（n，%）

3 讨 论

腰椎管狭窄症是40岁以上的中老年腰痛患者常见的腰椎疾病，黄韧带肥厚是其主要病因之一。腰椎管内黄韧带的肥厚可以引起腰痛及坐骨神经痛最初由Elsberg于1913年报道，Kaneyama等人[1]的研究表明，胸椎黄韧带肥厚与骨化、反复机械张力导致的损伤修复有关。但是，相同年龄和相同的力学环境并没有使所有人出现黄韧带的肥厚。

最近几年来，研究者们对细胞因子的作用越来越感兴趣，并对其研究也越来越受到重视。黄韧带肥厚的研究中与力学因素作用一样重视生物化学因素作用。贾连顺[3]等认为目前黄韧带骨化相关研究已较为普遍，但大部分以研究胸椎黄韧带为主，而腰椎黄韧带的生物特性和退变机制方面的研究很少。我们针对腰椎黄韧带做了文献分析并对黄韧带肥厚骨化做了初步研究得出结论黄韧带肥厚退变与细胞因子密切相关。艾尔肯·阿木冬[4]等在手术中也发现腰椎黄韧带肥厚明显。Park et al[5]等研究者对腰椎管狭窄患者在术中取出的腰椎黄韧带进行测量，发现其平均厚度为4.44 mm，比对照组患者的腰椎黄韧带（2.44 mm）明显厚。我们的标本基本符合上述厚度。Sairyo et al[6]等对77例10岁～85岁腰椎疾病患者的黄韧带进行统计学分析，总计308个节段，发现腰2至骶1节段的黄韧带厚度会随着患者年龄的增大而逐渐增加，其中腰3～5节段的黄韧带肥厚最为明显，且其进展也最快，我们的研究也符合上述研究。

我们通过HE染色发现黄韧带肥厚患者HE染色有纤维软骨变形，纤维排列紊乱，骨化及炎性细胞浸润表现，而没有黄韧带肥厚患者的黄韧带虽然有局部炎性改变外，没有钙化及骨化表现，纤维结构排列较整齐，二者差异显著。

当前针对TGF-β，也就是转化生长因子-β的研究最多。相关研究表明，TGF-β能加快成纤维细胞以及成骨细胞外基质合成的速度，并能起到有效抑制新合成基质讲解以及促进血管形成的作用。此外，也有报道称，TGF-β能显著提升胶原纤维的分泌量。Park等人[5]的研究表明，选择术中取出的的黄韧带，并对肥厚黄韧带以及非肥厚黄韧带进行TGF-β1浓度的检测，结果显示，前者的TGF-β1浓度明显比后者高。Nakatani等人[8]通过牵拉术中取出的腰椎黄韧带，并对其胶原纤维mRNA和TGF-β1水平进行检测，结果表明，牵拉之后的TGF-β1水平明显升高，并且，Ⅰ、Ⅲ以及Ⅴ型胶原纤维基因的表达能力也有所提高，但在加入TGF-β1抗体之后，胶原纤维mRNA水平则显著降低，在加入外源性TGF-β1之后，胶原纤维mRNA水平表现出剂量依赖性增加的现象，提示，牵拉黄韧带能够提高TGF-β1水平。可尽管如此，Sairyo等人[6]的研究却表明，当黄韧带肥厚增加之时，TGF-β水平将显著降低，而其它的一些研究也表明，瘢痕形成初期时，TGF-β会有表达，但在肥厚瘢痕愈合之后，TGF-β将会终止表达。所以，我们可以推测，黄韧带肥厚初期中，TGF-β发挥着较大的作用，能显著提高胶原纤维合成量。我们的初步研究也发现TGF-β在肥厚退变黄韧带中表达明显，但在黄韧带肥厚形成的后期中，其它促进胶原纤维合成的细胞因子亦或者是生长因子也有参与。

目前通过图片分析做面积（area）、平均光密度（density mean）、直径（diameter）、累积光密度（IOD：integrated optical density）的测量，这些是有意义的测量统计数值，但IOD却是总数（SUM）值更有意义。图片分析对比累积光密度总数见对照组为2.4312422，退变组为2.6556708，两者有明显的差别。说明黄韧带肥厚退变过程中有细胞凋亡起作用。

现阶段，有诸多研究倾向于随退变和椎间不稳所致的黄韧带反复损伤与纤维修复所引发的黄韧带肥厚，可这一过程当中也有多种细胞因子参与介导不同阶段的胶原纤维的合成。黄韧带肥厚过程中是否存在多种细胞因子参与及其相互间作用，具有网络性的特点，不能孤立讨论某种因子的作用。部分患者同一节段单侧黄韧带肥厚，而对侧并不肥厚的原因目前的生物力学、生物学机制都不能解释。理论上讲，对照标本应取健康的腰椎黄韧带，但这不符合医学伦理，因此在建立对照组的问题比较困难。目前腰椎黄韧带肥厚研究所用的对照组基本上都取自腰椎间盘突出症患者的黄韧带，但此类病人的腰椎也属于椎间不稳，同样存黄韧带的牵拉，这些被牵拉的黄韧带能分泌出相关的细胞因子亦或者是生长因子，可有效提高胶原纤维合成量，所以，对照组的标本量不能达到理想。如此一来，明确腰椎黄韧带肥厚的机制仍然是一个难题，还需要我们深层次的研究。

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