生物素标记的甲基化间区位点扩增技术分辨不同组织DNA甲基化水平方法初探

王小怡，王博，王雪伟，高哲，郭大玮

生物素标记的甲基化间区位点扩增技术分辨不同组织DNA甲基化水平方法初探

王小怡，王博，王雪伟，高哲，郭大玮

DNA 甲基化是重要的表观遗传修饰之一。在哺乳动物细胞中，DNA 甲基化参与基因表达和染色质结构的调控[1]，与多种癌症的发生发展相关[2-3]。DNA 甲基化在胚胎发育早期、个体生长发育及多种疾病的发生发展过程中起着重要的作用，是当前表观遗传研究领域的热点之一[4-5]。分析基因组中甲基化水平能够了解不同组织之间、正常与疾病状态以及不同年龄引起的甲基化水平的差异。Frigola 等[6]通过扩增甲基化间区位点（amplification of intermethylated sites，AMIS）分析了结肠癌组织与癌旁组织基因组中 CCCGGG位点的甲基化水平。该法通过 [α-33P]dATP 进行放射自显影，对机体有很大的损害。有文献报道可以用生物素标记的引物进行 PCR 扩增[7]，因此本研究尝试用生物素标记引物进行 PCR 扩增代替放射性核素法分析基因组 DNA 甲基化水平（图 1）。

图 1 生物素标记引物进行 PCR 扩增分析基因组 DNA 甲基化水平原理示意图（双线代表基因组 DNA）

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF 级 SD 大鼠 9 只，标记为 1 ～9 号，雄性，体重 180 ～ 200 g，购于中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心（许可证编号：SCXK-(军)2012-0004），饲养于山西医科大学实验动物中心。

1.1.2 主要试剂和仪器 限制性内切酶 Rsa I 和 CviQ I、T4 连接酶均购自美国 NEB 公司；PCR 产物纯化试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司；rTaq 聚合酶购自日本 Takara 公司；化学发光试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；TC-96/G/H(b)B 型基因梯度扩增仪购自杭州博日科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 9 只大鼠随机分为两组，1 ～ 4 号正常饲养；5 ～ 9 号脑部局部双侧给予 2 nmol/L 的 δ-阿片受体激动剂 1 μl。一周后处死大鼠，取心、脑、肝、肺、肾、脾、胰组织，置于–80 ℃ 备用。

图 2 5 号大鼠心、脑、肝组织以不同引物扩增时甲基化图谱

1.2.2 大鼠组织基因组 DNA 提取 酚氯仿法提取大鼠组织的基因组 DNA（100 ng/μl），A260/280在 1.8 ～ 1.9。

1.2.3 甲基化间区位点扩增 10 U 的甲基化敏感性内切酶 Rsa I 消化 1 μg 基因组 DNA，37 ℃ 过夜酶切，留下钝性末端（GT/AC）；酶切产物用 10 U 甲基化非敏感性内切酶 CviQ I 消化，25 ℃ 过夜酶切，留下粘性末端（G/TAC）。特异接头准备：100 μmol/L MCA-V（5' TATCAG AGCTTTGCGAAT 3'）和 100 μmol/L Blue（5' ATTCGCAAA GCTCTGA 3'）等体积混合置于 95 ℃ 10 min，室温约 2 h退火；1 nmol的接头与 1 μg 双酶切的产物在 T4 连接酶的作用下连接。PCR 产物纯化试剂盒纯化连接产物。

1.2.4 生物素标记的引物扩增两端连接特异接头的 DNA序列 用 5'-Bio-Blue-TAC 末端加 4 ～ 6 个随机核苷酸的引物进行 PCR 扩增，引物序列为 5'-Bio-Blue-TAC-CTGT-3，5'-Bio-Blue-TAC-CTGTG-3'，5'-Bio-Blue-TAC-CTGTGC-3'。扩增体系：30 ng 连接产物，4 μmol/L 生物素标记的引物，1 U rTaq，2 μl dNTP，2.5 μl 10 × PCR buffer，灭菌水补足25 μl。扩增条件：95 ℃ 10 min；94 ℃ 15 s，68 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35 个循环；72 ℃ 10 min。

1.2.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳 PCR 产物稀释 5 倍，3 μl稀释后产物与 12 μl 的变性上样缓冲液 DLB（95% 甲酰胺、20 mol/L EDTA、0.09% 溴酚蓝、0.09% 二甲苯青）混匀后 95 ℃ 变性 10 min，置于 –20 ℃ 备用。变性后样品上样 5 μl，8 mol/L 尿素、6% 的聚丙烯酰胺凝胶 200 V 恒压电泳 2 h。使用半干转印仪，以 0.5 × TBE 为转膜液，将凝胶上的 DNA 转移到尼龙膜上，电压保持在 6 ～ 11 V 的条件下恒流转膜 45 min。按化学发光 EMSA 试剂盒使用说明书进行显色。

2 结果

2.1 引物的选择以及同一只大鼠不同组织之间甲基化水平的比较

3' 末端随机核苷酸数目的增加能够减少扩增产物的条带数目，使甲基化图谱条带清晰且容易分析。条带灰度值越高说明甲基化水平越高。5 号大鼠的心、脑、肝组织分别以3' 末端增加 4、5、6 个核苷酸为引物扩增得到的甲基化图谱，随着末端核苷酸数的增加，条带数目逐渐减少（图 2）。选择 3' 末端增加 4 个碱基（即 Bio-Blue-TAC-CTGT）为引物来分析大鼠组织的甲基图谱，表明同一个引物同一只大鼠的不同组织的甲基化图谱有明显差异。

2.2 不同大鼠脑组织甲基化水平图谱基本一致

1 ～ 4 号大鼠的脑组织甲基化图谱基本一致。5 号大鼠经过局部脑阿片受体激动剂处理，其脑组织甲基化水平图谱与 1 ～ 4 号大鼠脑组织有较大差异（图 3）。

图 3 不同大鼠组织甲基化图谱

图 4 DNA 片段长度范围分析

2.3 甲基化位点之间 DNA 片段长度范围分析

采用本实验室现有的 H19 基因的引物，共用的上游引物 5' 端进行生物素标记，选择 5 个不同的下游引物扩增后产物等比例混合制成标准品，电泳时和样品一起上样。由图 4 可知电泳条带在 200 ～ 1200 bp。

3 讨论

用 AMIS 方法对基因组范围内的甲基化水平进行检测首先由 Frigola 等于 2002 年提出。实验中作者采用SmaI/PspA1（CCCGGG）这对内切酶及接头 DNA 巧妙地分离了甲基化与非甲基化状态的胞嘧啶。由于在全基因组范围内进行检测，因此，与预设甲基化位置的基因芯片检测方法相比，检测范围更加宽泛，例如：Illumina 推出的 Infinium Methylation EPIC BeadChip 一次可以检测超过 850 000 个甲基化位点[8]，但这些甲基化位点倾向于与已注释的基因表达调控相关，不免有检测局限性；根据 Fazzari 和 Greally[9]对人类基因组计划的资料分析表明，甲基化敏感酶 Hpa II的识别位点分布于人类已注释的 CpG 岛区域，约占总切点的 12%，其余大部分切点分布于其他未知的区域；Xu 等[10]在人类长片段重复序列检出了可能作为分辨同卵双生子DNA 甲基化位点，这些说明立足于整个基因组范围内检测DNA 甲基化的 AMIS 方法有其独特的优点。

另一方面，由于 AMIS 检测所涉及的片段较多，用普通显色方法灵敏度不够，因此，Frigola 等[6]采用了放射性检测方法 。本文用生物素标记的引物检测出了不同脏器的不同 DNA 甲基化水平。据 Frigola 的报道，同位素方法的检测灵敏度为 1/16，我们在实验过程中将样品稀释到 1/10仍能检测到甲基化条带。

与放射性同位素标记相比，生物素标记的引物 AMIS操作安全、简单，适用于多个样本，并能达到检测出不同脏器的不同 DNA 甲基化水平的目的。该方法的灵敏度较高，少量的产物即可得到清晰的基因组 DNA 甲基化水平图谱。因此，我们认为虽然非放射性 AMIS 的检测灵敏度低于放射性标记，但 1 μg 的 DNA 模板用生物素标记的AMIS 法已然能够检出足够条带，从而满足多数实验的要求。如此可以避免放射性核素的使用。

本文通过非放射性 AMIS 替代放射性方法，得到了较为清晰的酶切位点基因组 DNA 甲基化水平图谱。同一只大鼠的不同组织甲基化水平有明显差异，而不同大鼠同一个组织的甲基化水平基本一致。唐韶青等[11]用 MSAP 技术对猪、牛、羊、小鼠、鸡和鸭的基因组 DNA 甲基化水平检测，发现同一动物的不同组织基因组 DNA 甲基化水平有差异。另有文献报道，人的不同组织之间甲基化水平也是有差异的[12-13]，这与本研究结果一致。

本文中采用 Rsa I/CviQ I（GTAC）内切酶对进行检测，观察了基因组中非 CpG 二核苷酸处的甲基化修饰情况。与Frigola 等所用的 6 核苷酸内切酶相比，我们采用的识别4 核苷酸的内切酶理论上可能检出更多的甲基化位置，采用3 端增加 4 ～ 6 个碱基的引物扩增，仍然能够得到较多的条带，更适用于两个样本间甲基化差异较少的检材。此外，4 核苷酸内切酶分析甲基化水平得到的甲基化间区的 DNA 范围 200 ～ 1200 bp，较 Frigola 等所用的 6 核苷酸内切酶得到的范围窄，这是因为 4 核苷酸比 6 核苷酸出现的频率高。

该方法的使用也存在一些局限性。图 3 中 1 ～ 4 脑组织是鼠龄、体重情况一致的大鼠，其甲基化水平基本一致。若在脑局部给阿片受体激动剂（5 号大鼠），则其脑组织甲基化图谱与 1 ～ 4 鼠脑组织有明显不同，慢性使用阿片导致脑组织的 DNA 甲基化水平发生改变已有报道[14]，本实验也观察到经上述处理的鼠甲基化水平图谱异于未处理鼠。可见药物等会影响个体基因组甲基化格局的改变。此外，基因组水平 DNA 甲基化与年龄、疾病等亦有着密切的关系[15-17]。上述问题在使用该方法鉴别不同组织时应加以考虑。此外，由于该方法基于内切酶酶切，因此对 DNA 质量要求较高，对于 DNA 降解的样本则无法进行检测。脾脏 DNA 提取后琼脂糖凝胶电泳发现 DNA 降解严重，这可能是导致图 4 四个脾组织之间的甲基化格局不同的原因。因而，使用该方法应注意 DNA 提取质量，避免 DNA降解；同时，比较样品间的 DNA 甲基化差异应保持实验条件的齐同。

本次研究初步探索了用生物素标记的 AMIS 法替代放射性 AMIS 法进行大鼠脑组织甲基化水平检测的可能性。后续我们期待用该方法探索其他组织的甲基化图谱，找出各种组织之间基因组 DNA 的甲基化差异，以期用甲基化水平来区分不同组织。

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国家发改委、科技部印发高级别生物安全实验室体系建设规划（2016 – 2025年）

按照国务院《病原微生物实验室生物安全管理条例》等有关要求，国家发展和改革委员会会同有关部委联合编制了《高级别生物安全实验室体系建设规划（2016 – 2025 年）》。

详情请登录国家发展和改革委员会网站 http://www.ndrc.gov.cn/zcfb/zcfbtz/201612/t20161220_830455.html 查阅。

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2017.01.016

030001 太原，山西医科大学法医学院

郭大玮，Email：guo8dawei@aliyun.com

2016-09-20