趋化因子受体CXCR4在肾癌组织中的表达及其调控机制研究

彭迪，刘钊，李锦楠，张晓艳，王浩，王华，肖凤君，张忠涛，胡泽斌，王立生，吴学杰，杨月峰

趋化因子受体CXCR4在肾癌组织中的表达及其调控机制研究

彭迪，刘钊，李锦楠，张晓艳，王浩，王华，肖凤君，张忠涛，胡泽斌，王立生，吴学杰，杨月峰

目的研究趋化因子受体 CXCR4 在肾癌患者肿瘤组织中的表达水平，探讨 CXCR4 表达调控的可能机制。

受体，CXCR4； 肾肿瘤； 转化生长因子 β；细胞运动

近年来，我国肾癌的发病率呈逐年上升的趋势，仅次于膀胱癌，位居男性泌尿系统恶性肿瘤的第二位[1]。肾癌早期症状并不明显，同时，我国尚未建立完善的肾癌筛查体系，因此，往往发现较晚，失去了治疗的最佳时机。肾癌对放疗和化疗均不太敏感，因此，传统的治疗方法以手术切除为主。近年来，随着免疫治疗、基因治疗等技术的发展与突破，分子靶向治疗有望为肾癌的治疗带来突破。

趋化因子受体 CXCR4（C-X-C motif chemokine receptor 4）是含有 7 个跨膜区的 G 蛋白偶联受体家族成员，它表达于多种组织和器官中。CXCR4 参与体内多种生理机制，包括参与 HIV-1 病毒侵染，造血功能，胚胎发育及肿瘤发生、发展及迁移等。基质细胞衍生因子 1（stromal cell-derived factor 1，SDF-1）是 CXCR4 唯一配体，SDF-1/CXCR4 信号通路的激活，在多种恶性肿瘤，如非小细胞肺癌、前列腺癌、乳腺癌等的转移过程中发挥重要作用[2-5]。同时，近年来对于 CXCR4 分子及其机制研究的进一步深入，发现 CXCR4 是结直肠癌肝转移预后和复发预测的重要分子；是胰腺癌肿瘤放化疗后复发风险评估的理想分子之一；能够作为预测肿瘤患者的药物敏感性的重要指标等[6-8]。本课题拟通过检测肾癌组织 CXCR4 的表达水平，明确其在肾癌发生、发展中的作用；同时，通过体外试验，阐明其上游调控机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病例标本 收集 2014 年 5 月 – 2016 年10 月于中国人民武装警察部队总医院行肾癌手术切除患者的癌组织和癌旁组织，共 12 例，其中，男性 8 例，女性 4 例，平均年龄 53.5 岁（29 ～78 岁）。患者术前未接受任何形式的放疗、化疗。病例标本收集后冻存于液氮中，后续用于 RNA 提取和基因表达检测。

1.1.2 细胞系 人胚肾细胞 HEK293 培养于10% 胎牛血清（FBS）的 DMEM 培养基中；正常人肾脏细胞 HKC、人肾癌细胞 786O、769P（本实验室保存），培养于 10% FBS 的 1640 培养基。

1.1.3 重组腺病毒 重组腺病毒 Ad(E1-).sT 为携带可溶性转化生长因子 β（transforming growth factor β，TGF-β）受体 II-人 IgGFc 融合蛋白（sTGF-βRIIFc）的复制缺陷型重组腺病毒；Ad(E1-).Null 为不携带外源基因的复制缺陷型腺病毒载体[9]。重组腺病毒载体均由 Adeasy 系统制备获得病毒，采用氯化铯密度梯度离心纯化病毒，采用紫外分光光度法测定病毒滴度和纯度[10-11]。

1.1.4 主要试剂与仪器 人胚肾细胞 HEK 293购自 ATCC；Trizol 购自美国 Sigma 公司；AMV逆转录酶、SYBR Premix EX TaqTMII 实时定量聚合酶链反应（PCR）检测试剂盒购自日本 Takara 公司；1640 培养基、DMEM 培养基购自美国HyClone 公司；FBS 购自浙江天杭生物科技股份有限公司；抗 IgGFc 抗体购自美国 Jackson Immuno Research 公司。无水乙醇、异丙醇等化学试剂购自北京化学试剂公司。人 CXCR4 基因、人 TGF-β基因和管家基因 β-actin 引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成，其序列为：人 CXCR4 引物，上游 5' acgccaccaacagtcaga 3'，下游：5' aagtcg ggaatagtcagc 3'；人 TGF-β 引物，上游，5' gcaacaattc ctggcgatac 3'；下游，5' caaccactgccgcacaact 3'；人β-actin 引物，上游，5' gggacctgactgactacctc 3'，下游，5' cttaatgtcacgcacgatt 3'。

1.2 方法

1.2.1 实时定量 PCR 检测 CXCR4 在肾癌组织中的表达水平 在液氮保护下研磨冻存肾癌标本组织和癌旁组织（约 100 mg），加入 1 ml Trizol，常规方法提取 RNA。采用紫外吸收测定法测定RNA 浓度和纯度；并按照 AMV 逆转录酶试剂盒说明进行反转录，获得 cDNA 样本。然后，以 cDNA为模板 PCR 扩增人 CXCR4 和 β-actin，引物序列如上所述。反应条件为 95 ℃ 预变性 10 min，95 ℃ 变性 15 s，60 ℃ 退火加延伸 1 min，共40 个循环。以 β-actin 为对照，采用 2-ΔCT，分析肾癌组织及癌旁组织中 CXCR4 的相对表达量。

1.2.2 TGF-β 在肾癌细胞系的表达水平 将对数生长期的人肾脏细胞系 HKC 以及人肾癌细胞系 769P 和 786O，分别提取 RNA，并进行反转录。采用实时定量 PCR 检测目的基因 TGF-β 的表达。

1.2.3 Ad(E1-).sT 在人肾癌细胞 786O 中表达效率的检测 人肾癌细胞 786O，每孔以 2 × 105个细胞/2 ml 接种于六孔板中，过夜培养后，重组腺病毒 Ad(E1-).sT 和对照病毒 Ad(E1-).Null 分别以25 000 VPs/细胞的强度感染细胞，感染后 48 h，Western blot 检测目的基因 sTGF-βRIIFc 的表达水平。

1.2.4 阻断 TGF-β 信号对人肾癌细胞 CXCR4表达的影响 人肾癌细胞 786O，每孔以 3 × 105个细胞/2 ml 接种于六孔板中，过夜培养后，重组腺病毒 Ad(E1-).sT 和对照病毒 Ad(E1-).Null 分别以10 000 VPs/细胞的强度感染细胞。孵育 24 h 后，更换新鲜的完全培养基，并加入 2 ng/ml 的重组人TGF-β 进行刺激，以未刺激细胞作为对照。刺激后24 h，收集细胞，提取 RNA 并进行反转录，采用实时定量 PCR 检测 CXCR4 的表达水平。

1.2.5 划痕实验 人肾癌细胞 786O 细胞以每孔6 × 105个细胞/2 ml 接种于六孔板中，24 h 后，采用 5000 VPs 的 Ad(E1-).sT 和 Ad(E1-).Null 感染细胞，4 h 后更换新鲜的完全培养基；感染后 24 h进行划痕，并更换培养基，加入 2 ng/ml 的 TGF-β，继续培养。分别于划痕后即刻、6、12、24 h 观察划痕愈合情况并拍照，计算愈合率，明确细胞的迁移作用。

1.3 统计学处理

本研究采用 prism5.0 进行统计分析，以?±s 进行描述，病例标本采用配对 t 检验；其他数据采用方差分析，并结合 t 检验进行两两比较。四个时间点拍照，测量划痕愈合情况。以 P ＜ 0.05表示具有差异，P ＜ 0.01 表示具有显著性差异。

2 结果

2.1 CXCR4 在肾癌组织中表达上调

12 例未经放、化疗的肾癌患者，在手术治疗过程中获得的癌组织和癌旁组织，经实时定量 PCR检测，结果显示，肿瘤组织中 CXCR4 的表达水平显著提升（与癌旁组织相比，P ＜ 0.05）。其中，有8 例患者表达上调，占所有病例数的 66.7%，如图 1 所示。上述结果提示，CXCR4 表达上调在肾癌的发生、发展过程中可能发挥重要作用。

图 1 肾癌患者肿瘤组织中 CXCR4 的表达检测（**P ＜0.01）Figure 1 CXCR4 expression in tumor tissues of renal cancer patients (**P ＜ 0.01)

2.2 肾癌细胞 TGF-β 表达上调

为探索肾癌组织中 CXCR4 上调的机制，在肾癌细胞系中，对其可能的上游分子 TGF-β 进行检测。以肾小管细胞 HKC 为对照，实时定量 PCR结果显示，TGF-β 在肾癌细胞 769P 和 786O 中均表达上调（与 HKC 组比，P ＜ 0.001），且 786O细胞中的表达水平最高（与 769P 细胞组比，P ＜0.001）（图 2）。上述结果提示，在肾癌细胞中，TGF-β 可能是介导 CXCR4 表达上调的重要分子，而 786O 是理想的细胞模型。

2.3 TGF-β 可在体外诱导 CXCR4 的表达

为检测 TGF-β 在 CXCR4 表达中的调控作用，首先将 786O 细胞感染重组腺病毒 Ad(E1-).sT和对照病毒 Ad(E1-).Null，通过 Western blot 检测可见，Ad(E1-).sT 在 786O 细胞中高效介导目的基因 sTGF-βRIIFc 的表达（图 3）。

然后，对感染 Ad(E1-).Null 和 Ad(E1-).sT 的786O 细胞，进行 2 ng/ml 的重组人 TGF-β 刺激，24 h 后检测 CXCR4 的表达水平。结果显示，2 ng/ml TGF-β 可高效诱导 CXCR4 的表达，而采用重组腺病毒 Ad(E1-).sT 阻断 TGF-β 受体后，诱导作用消失（图 4）。上述结果提示，TGF-β 受体信号通路在肾癌细胞 CXCR4 表达上调过程中发挥至关重要的作用。

2.4 Ad(E1-).sT 干预可抑制 786O 细胞的迁移作用

Ad(E1-).sT 干预后，采用划痕实验检测了 786O细胞的迁移能力。图 5 显示，与 Ad(E1-).Null 组相比，Ad(E1-).sT 可以显著抑制 786O 细胞的迁移作用。表明，TGF-β 在肾癌转移过程中发挥作用，而 TGF-β 有可能通过上调 CXCR4 发挥其功能。

图 2 实时定量 PCR 检测 TGF-β 在肾癌细胞系中的表达水平（***P ＜ 0.001 vs HKC；###P ＜ 0.001vs 769P）Figure 2 The expression of TGF-β was detected by real-time quantitative PCR in renal cancer lines (***P ＜ 0.001 vs HKC;###P ＜ 0.001 vs 769P)

图 3 Ad(E1-).sT 感染 786O 细胞后 sTGF-βRIIFc 表达检测Figure 3 Expression of sTGF-βRIIFc in 786O cells infected by Ad (E1-).sT

图 4 实时定量 PCR 检测 TGF-β 刺激后，786O 细胞中CXCR4 的表达水平（***P ＜ 0.001vs Ad(E1-).Null + mock；###P ＜ 0.001 vs Ad(E1-).Null + TGF-β）Figure 4 The expression of CXCR4 were detected by real-time quantitative PCR in TGF-β stimulated 786O cells (***P ＜ 0.001 vs Ad(E1-).Null plus mock group;###P ＜ 0.001 vs Ad(E1-).Null plus TGF-β group)

图 5 Ad(E1-).sT 对 786O 细胞迁移的影响[*P ＜ 0.05 vs对照；#P ＜ 0.05 vs Ad(E1-).Null]Figure 5 Effects of Ad (E1-).sT on migration of 786O cells [*P ＜ 0.05 vs control;#P ＜ 0.05 vs Ad(E1-).Null]

3 讨论

TGF-β 作为多功能的细胞因子，在肿瘤发生、发展、远端转移等过程中发挥重要作用。在乳腺癌、前列腺癌骨转移患者的外周血中，均能检测到高水平的 TGF-β[12]；而在晚期肾癌患者的肿瘤局部，TGF-β 表达显著提升。TGF-β 可以通过多种机制影响肿瘤的发生、发展和转移：如 TGF-β 通过 PI3K/Akt/mTOR 通路上调缺氧诱导因子（hypoxia-inducible factors，HIFs）表达，促进肿瘤生长；通过 Scr/Fak/Akt 通路上调 VEGF 表达，促进血管生成[13-14]；通过诱导溶骨相关因子的表达（IL-11、PTHrP、CTGF），促进肿瘤骨转移的发生和发展等[15-16]。同时，TGF-β 也是重要的免疫调节因子，可通过多种机制抑制肿瘤微环境的抗肿瘤免疫，包括：增强骨髓来源抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）的聚集；诱导 CD4+T 细胞分化为 CD4+Foxp3+调节性 T 细胞（regulatory T cells，Tregs）；下调 NK 细胞和 CD8+T 细胞表面 NKG2D 受体，进而减弱其细胞毒效应等[17-19]。

CXCR4 是一种 TGF-β 的重要靶基因，可通过 SDF-1/CXCR4 信号，发挥细胞内肌动蛋白聚合、骨架重构、伪足形成、细胞运动及侵袭力增加[20]等生物学活性。本课题中，对肾癌患者的肿瘤标本和癌旁组织进行了 CXCR4 表达的检测，结果显示，CXCR4 在肿瘤组织中表达显著上调，提示CXCR4 在肾癌的发生、发展过程中发挥重要作用。那么，肾癌组织中 CXCR4 的表达上调是由 TGF-β诱导的吗？我们的结果证实，TGF-β 在肾癌细胞中表达上调；外源 TGF-β 刺激可以诱导 CXCR4 的表达；同时，阻断 TGF-β 可以抑制 TGF-β 诱导的 CXCR4 表达和肾癌细胞的迁移能力。上述结果表明，CXCR4 作为 TGF-β 的重要靶基因，在肾癌发生、发展和转移过程中发挥重要作用，有望成为肿瘤治疗的重要靶标。

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Expression of chemokine receptor CXCR4 in renal cancer patients and its regulatory mechanisms

PENG Di, LIU Zhao, LI Jin-nan, ZHANG Xiao-yan, WANG Hao, WANG Hua, XIAO Feng-jun, ZHANG Zhong-tao, HU Ze-bin, WANG Li-sheng, WU Xue-jie, YANG Yue-feng

ObjectiveTo study the expression of chemokine receptor CXCR4 in the tumor lesions of renal cancer patients and its possible regulatory mechanisms.MethodsThe tumor and adjacent tissues were collected and RNA was then extracted. RT-PCR was conducted to detect the expression of CXCR4 in tumor and adjacent tissues. The mRNA expression of transforming growth factor β (TGF-β) in human renal proximal tubular epithelial cell line HKC, and renal cancer cell lines, 769P and 786O were examined using real-time RT-PCR. Replication deficiency adenovirus Ad(E1-).sT and its control Ad(E1-).Null were transfected into 786O cells. TGF-β were added 24 h later for stimulation, and the expression of CXCR4 were detected using real-time RT-PCR. In addition, 24 h after adenoviruses infection, the ability of cell migration were observed by wound healing examination.ResultsThe expression of CXCR4 is much higher in the tumor lesions than that in the para-cancerous tissues. Among total 12 selected patients, CXCR4 was up-regulated in the tumor lesions of 8 patients. Moreover, compared with human renal proximal tubular epithelial cells, the expression of TGF-β, upstream regulator of CXCR4, was significantly increased. In 786O cells, stimulation with TGF-β could up-regulate the expression of CXCR4. Furthermore, Ad(E1-).sT not only inhibit TGF-β-induced CXCR4 expression, but also decreased cellular migration ability.ConclusionCXCR4 expression is increased in tumor lesions of most renal cancer patients, and is regulated by TGF-β. Our results suggest that CXCR4 is a promising target for the therapy of renal cancer.

Receptor, CXCR4; Kidney neoplasms; Transforming growth factor beta; Cell movement

s:WU Xue-jie, Email: drwxj@sinna.com; YANG Yue-feng, Email: yuefengyang1981@163.com

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2017.01.004

Chin Med Biotechnol, 2017, 12(1):19-23

国家“863”青年科学家专题项目（SS2014AA020515）；国家自然科学基金（81402558、81472396）

100039 北京，中国人民武装警察部队总医院泌尿外科（彭迪、李锦楠、吴学杰）；100850 北京，中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所实验血液学研究室（彭迪、刘钊、李锦楠、张晓艳、王浩、王华、肖凤君、王立生、杨月峰）；100050 北京，首都医科大学附属北京友谊医院普通外科（刘钊、张忠涛）；100050 北京，中国食品药品检定研究院体外诊断试剂所（胡泽斌）

吴学杰，Email：drwxj@sinna.com；杨月峰，Email：yuefengyang1981@163.com

2016-12-12

方法收集肾癌患者（未接受放化疗）的肿瘤组织和癌旁组织，将组织研磨后提取 RNA，采用实时定量 RT-PCR 检测肿瘤组织和癌旁组织中 CXCR4 的表达水平；采用实时定量 RT-PCR 检测肾小管细胞 HKC 以及肾癌细胞系769P 和 786O 中 TGF-β 的表达水平。复制缺陷型腺病毒 Ad(E1-).sT 和对照病毒感染 786O 细胞后 24 h，采用2 ng/ml 的重组人 TGF-β 刺激 24 h，收集细胞，采用实时定量 RT-PCR 检测目的基因 CXCR4 的表达水平。同时，病毒感染后 24 h，采用划痕法检测 786O 细胞的迁移能力。结果在肾癌患者中，肿瘤组织的 CXCR4 表达显著高于癌旁组织：12 例患者中，有 8 例表达上调。与正常肾小管细胞相比，肾癌细胞系 769P 和 786O 中，CXCR4 的上游分子 TGF-β 表达上调。在 786O 细胞中，TGF-β 刺激可以显著提升 CXCR4 的表达水平；而 Ad(E1-).sT 可以在786O 细胞中高效介导 sTGF-βRIIFc 的高效表达，并抑制CXCR4 的表达和细胞的迁移能力。

结论CXCR4 在肾癌组织中普遍表达上调，并受到 TGF-β的调控，有望成为肾癌治疗的重要靶标。

www.cmbp.net.cn 中国医药生物技术, 2017, 12(1):19-23

Author Affiliations:Department of Urology, General Hospital of People's Armed Police Forces China, Beijing 100039, China (PENG Di, LI Jin-nan, WU Xue-jie); Department of Experimental Hematology, Beijing Institute of Radiation Medicine, Beijing 100850, China (PENG Di, LIU Zhao, LI Jin-nan, ZHANG Xiao-yan, WANG Hao, WANG Hua, XIAO Feng-jun, WANG Li-sheng, YANG Yue-feng); Department of General Surgery, Beijing Friendship Hospital, Capital Medical University, Beijing 100050, China (LIU Zhao, ZHANG Zhong-tao); Institute for in Vitro Diagnostic Reagents Control, the National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050, China (HU Ze-bin)

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