长链非编码RNA CCAT1对人宫颈癌XB1702细胞裸鼠移植瘤放射敏感性的影响

高金苹，张绍菊，罗志红，李津

长链非编码RNA CCAT1对人宫颈癌XB1702细胞裸鼠移植瘤放射敏感性的影响

高金苹，张绍菊，罗志红，李津

目的探讨长链非编码 RNA（lncRNA）结肠癌相关转录因子 1（CCAT1）对宫颈癌 XB1702 细胞裸鼠移植瘤放射敏感性的影响。

方法通过电穿孔法分别将 CCAT1 siRNA 和重组表达载体 pcDNA3.1-CCAT1 转染人宫颈癌 XB1702 细胞后，G418 筛选得到稳定转染细胞系，实验分为 3 组：CCAT1 siRNA 转染组、pcDNA3.1-CCAT1 转染组和空白对照组。转染 48 h 后，RT-PCR 检测细胞中 CCAT1 lncRNA 表达水平；CCK8 检测细胞增殖，TUNEL 法检测细胞凋亡影响；裸鼠移植瘤实验检测上调和下调 RNA CCAT1 表达联合 X射线照射对宫颈癌的生长抑制作用。

结果干扰 XB1702 细胞中 CCAT1 lncRNA 表达后，XB1702 细胞增殖被抑制，细胞凋亡率增加；裸鼠移植瘤平均体积明显小于对照组（正常 XB1702 细胞种植组）差异有统计学意义（P < 0.05）；上调 XB1702 细胞中 CCAT1 lncRNA 表达后，XB1702 细胞增殖能力明显增强，细胞凋亡率降低，差异有统计学意义（P < 0.05），而上调组裸鼠皮下种植瘤平均体积较照射前无明显变化。

结论下调 CCAT1 mRNA 表达能抑制人宫颈癌 XB1702细胞裸鼠移植瘤的生长，增强瘤体的放射敏感性。

宫颈肿瘤； 肿瘤移植； 小鼠，裸； XB1702细胞； 长链非编码 RNA

宫颈癌是一种严重威胁女性生殖健康的疾病，全世界每年有近 13 万女性被确诊为宫颈癌患者[1-3]。临床上宫颈癌患者由于术后存在高危因素或局部肿瘤过大常需要进行放疗，增强宫颈癌细胞的放射敏感性尤为重要[4-6]。长链非编码 RNA（lncRNA）是近年来研究的一大热点。研究表明，结肠癌相关转录因子 1（CCAT1）在结肠癌组织中表达异常[7-9]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 6 周龄健康 BALB/c 裸鼠36只，体重 100 ～ 120 g，均为雄性，由河北医科大学动物实验中心提供。室温 25 ℃，湿度 50% ～80%，SPF 环境下自由饮水和采食。

1.1.2 仪器和试剂 DMEM 完全培养基中包含2 mmol/L L-谷氨酞胺、10% FBS、1 mmol/L 丙酮酸钠、100 mg/ml 青霉素链霉素二抗；BCA 蛋白浓度测试试剂盒（增强型）、5 × SDS 蛋白上样缓冲液、20 × TBS 缓冲液等购自南京建成生物工程研究所；胰蛋白酶购自美国 Sigma 公司；PBS 磷酸缓冲液购自美国 Hyclone 公司；细胞培养箱购自德国HeraesSepatech 公司；Trizol 试剂盒购自美国Invitrogen 公司。

1.2 方法

1.2.1 实验模型的建立及分组 将冻存的宫颈癌XB1702 细胞置于 60 ℃ 恒温水浴箱，30 s 内进行细胞的快速复苏。细胞液融化后迅疾转入 EP 管并加入 DMEM 培养基，重复小心吹打细胞使其均匀分布，随后离心弃上清液。将复苏后的细胞用LG-DMEM 完全培养基调整为 1 × 106个/ml 的密度进行培养。

将培养 24 h 的细胞取出，分为 3 组，分别为CCAT1 siRNA 转染组、pcDNA3.1-CCAT1 转染组和空白对照组。

1.2.2 基因转染 CCAT1 siRNA 和重组真核表达载体 pcDNA3.1-CCAT1 分别由上海生工生物工程有限公司合成。用 HeBS 液[140 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl、0.75 mmol/L Na2HPO4、6 mmol/L 葡萄糖、25 mmol/L 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸]重悬计数；调整细胞密度约为 5 ×106个/ml，每次取 200 μl细胞悬液加入电击杯，分别向三个处理组加入 4 μg CCAT1 siRNA、生理盐水、pcDNA3.1-CCAT1，电击后室温静置 2 min，然后分别加入培养液培养48 h。G418 筛选得到稳定转染的细胞系后，将其扩大培养。

随机选取首都医科大学2013级临床和基础医学等专业60名学生作为研究对象，将60名学生分为10个小组，每组5～7人。

1.2.3 RT-PCR 检测 CCAT1 lncRNA 表达 转染48 h后，取出细胞，离心弃上清收集细胞。基因相对表达水平采用 RT-PCR 进行测定。通过 Primer Primer 5.0 软件设计引物，CCAT1 引物序列上游：5' CCAATTGAACCGAGCCTTGT 3'；下游：5' TCGT GAGCGTTTTCGCAATG 3'，目的片段长度 298 bp。参照物 GAPDH 引物序列上游：5' TCCTCTGACT TCAACAGCGACAC 3'；下游5' TCTCTCTTCCTCT TGTGCTCTTGC 3'，片段长度为 176 bp。反应后琼脂糖凝胶电泳并成像仪摄片，用 Image proplus6.0图像分析软件测算电泳条带的 OD 值，进而计算其相对表达量。

1.2.4 CCK8 检测细胞的增殖能力 人宫颈癌XB1702 细胞经过 CCAT1 siRNA 和重组表达质粒转染后继续培养，CCK8 法测定培养 48 h 后细胞的增殖活化能力。具体方法为转染 48 h 之后，将3 组细胞分别收集接种到 96 孔细胞培养板上，每组 3 个重复；细胞培养箱中培养至细胞贴壁后继续培养 48 h，向各孔中分别加入 20 μl CCK8 稀释液，振荡细胞板后继续培养 1 h，用酶标仪在 490 nm波长下测定吸光度（OD）。

1.2.5 TUNEL 法检测细胞凋亡影响 转染培养48 h 后，轻轻吹打细胞，使之均匀分布。PBS 磷酸缓冲液洗涤，洗涤后滴加原位末端标记反应混合液 50 μl，在湿盒中 37 ℃ 孵育 1 h，滴加 POD2转化液 50 μl，湿盒 37 ℃ 孵育 30 min，pH 7.4 的磷酸缓冲液冲洗 3 次，二氨基联苯胺（DAB）显色，HE 复染，显微镜下分析图像。棕黄色细胞核的细胞为凋亡细胞，计数凋亡细胞和总细胞数，计算细胞凋亡率。

1.2.6 检测 RNA CCAT1 表达联合 X 射线照射对宫颈癌的生长抑制作用 选取 36 只裸鼠随机平均分三组，CCAT1 基因沉默组、CCAT1 重组表达载体转染组和空白对照组。分别取转染培养 48 h后的各组细胞胰酶消化重悬，将之分别接种于相应组裸鼠右腋皮下 0.5 cm 处。裸鼠在无菌、通风、洁净的 SPF 级动物房中饲养，接种后 1 周左右，在裸鼠的接种区出现米粒大小的移植瘤。各组分别挑取 4 只裸鼠处死并分离肿瘤组织后，计算放射前肿瘤瘤块体积。其余各组裸鼠麻醉处理，将之固定于解剖板上，进行放疗处理。放疗处理后第 40 天进行放疗后肿瘤瘤块体积的计算和统计。该实验重复进行 3 次。

1.3 统计学处理

本实验使用生物统计学软件 SPSS16.0 进行统计学分析，细胞实验至少重复 3 次，所有数据以?±s 表示，组间比较采用单因素方差分析，移植瘤体积数据统计采用重复测量方差分析，并作多重比较，以 P ＜ 0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 CCAT1 lncRNA 的表达

图 1 为 CCAT1 基因修饰转染后宫颈癌XB1702 细胞中 CCAT1 基因相对表达水平。与空白对照组相比，CCAT1 siRNA 转染组显著降低了宫颈癌 XB1702 细胞中该基因 mRNA 相对表达水平（P < 0.05），而 CCAT1 siRNA 转染组表达质粒转染明显提高了宫颈癌细胞中 CCAT1 基因的相对表达水平（P < 0.05）（图 1B），提示基因转染成功。

2.2 细胞的增殖能力

如图 2 所示，pcDNA3.1-CCAT1 转染组的XB1702 细胞增殖活性显著高于空白对照组和基因沉默组（P < 0.05），与对照组和 pcDNA3.1-CCAT1转染组相比，CCAT1 siRNA 转染组细胞的增殖能力明显降低（P < 0.05）。与对照组相比较，基因沉默组和基因重组表达质粒转染组细胞的增殖活性分别降低和提高了 36% 和 19%。

2.3 细胞凋亡

对照组、基因沉默组和基因重组表达质粒转染组中，宫颈癌 XB1702 细胞凋亡率分别为 8.6%、15.4% 和 5.3%。其中基因沉默组最高，显著高于其他两组；与空白对照组相比，pcDNA3.1-CCAT1转染组的宫颈癌 XB1702 细胞凋亡率显著降低（P < 0.05）（图 3）。

图 1 CCAT1 基因修饰转染后宫颈癌 XB1702 细胞中 CCAT1 基因相对表达水平（A：各组 CCAT1 lncRNA 的电泳图；B：各组 CCAT1 lncRNA 的表达水平）Figure 1 Relative expression of CCAT1 gene in cervical cancer XB1702 cells transfected with CCAT1 gene (A: Electrophoregram of each group of CCAT1 lncRNA; B: Expression level of CCATl lncRNA in each group)

图 2 CCAT1 基因对宫颈癌 XB1702 细胞增殖活性的影响Figure 2 Effect of CCAT1 gene on the proliferation of cervical cancer XB1702 cells

图 3 CCAT1 基因对宫颈癌 XB1702 细胞凋亡的影响Figure 3 Effect of CCAT1 gene on the apoptosis of cervical cancer XB1702 cells

2.4 对宫颈癌的生长抑制作用的影响

CCAT1 siRNA转染组裸鼠移植瘤平均体积明显小于对照组（P < 0.05），上调 XB1702 细胞中CCAT1 lncRNA 表达后，XB1702 细胞增殖能力明显增强，细胞凋亡率降低（P ＜ 0.05），而pcDNA3.1-CCAT1 转染组裸鼠皮下种植瘤平均体积较照射前无明显变化（表 1）。把治疗前和治疗后看做两次重复测量，F = 19.55，P < 0.01，两两比较均 P < 0.01。

表 1 放疗前后各组宫颈癌的生长抑制作用的影响（cm3）Table 1 Inhibitory effect of radiotherapy on cervical cancer growth (cm3)

3 讨论

尽管长链非编码 RNA 不具有其他编码 RNA翻译蛋白质的功能，但因其具有独特的空间结构，并可定位于胞核或者胞质；其具有复杂的生物学功能，如参与染色质重构、RNA 剪接等[12]。其作用机制主要包括：①募集染色质修饰酶复合物及目标基因区域，参与靶基因染色质的表观遗传学修饰；②根据碱基互补配对原则，参与 mRNA 前体修饰和剪接等；③可作为分子支架，不同结构域可结合不同的蛋白质复合体，从而引导相关的大分子复合体在目标区域组装以协同发挥调控作用；④作为诱饵分子与蛋白质或 miRNA 结合，调控相关基因的表达[13-16]。正常细胞中，只有肝脏细胞和小肠细胞可以检测到微量的 CCAT1，而其他细胞则检测不到该基因表达。本试验在进行 CCAT1 siRNA 和PcDNA3.1-CCAT1 基因转染后，CCAT1 的基因表达发生显著变化。基因沉默组 CCAT1 基因表达水平显著下降；而基因重组表达质粒转染组 CCAT1 的 mRNA 相对表达水平显著提高，提示本试验基因成功转染。

通过转染 CCAT1 siRNA 质粒，下调了该基因在宫颈癌细胞中的基因表达，进而提高了癌细胞的放射敏感性。在进行放射治疗时，移植瘤的生长和发展水平明显得到了抑制。然而，目前就 CCAT1基因与宫颈癌细胞的放射敏感性之间关系的研究还是空白。有研究表明，c-MYC 基因表达水平与肿瘤细胞的放射敏感性呈高度正相关。因此，CCAT1 参与调控的 c-MYC 基因转录也可能是改变细胞敏感性的原因之一，但其机制上需进一步证明。本试验在上调 CCAT1 的基因表达水平后发现，与放射治疗之前相比，裸鼠的移植瘤无明显改变，这一结果与对照组相比有明显的统计学意义。

研究结果提示，CCAT1 可能是决定宫颈癌XB1702 细胞的关键基因。其上调的表达水平会使癌细胞丧失放射敏感性。由于长链非编码基因CCAT1 在宫颈癌细胞中的研究较少，因此本研究首次探究了 CCAT1 基因与宫颈癌细胞增殖凋亡和移植瘤生长发展的关系。研究显示，下调宫颈癌细胞中的 CCAT1 基因可以明显抑制癌细胞的增殖，抑制肿瘤的生长。随着分子生物学的发展，长链非编码基因干预可能会为治疗宫颈癌提供新策略。

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Impact of long non-coding RNA CCAT1 on the tumor sensitivity to radiotherapy in nude mice transplanted with human cervical cancer cells XB1702

GAO Jin-ping, ZHANG Shao-ju, LUO Zhi-hong, LI Jin

ObjectiveTo investigate the effect of long non-coding RNA (lnRNA) CCAT1 on the tumor sensitivity to radiotherapy in nude mice transplanted with human cervical cancer cells XB1702.MethodsThe human cervical cancer XB1702 cells were divided into 3 groups: control group, CCAT1 siRNA group and pcDNA3.1-CCAT1 group. The CCAT1 siRNA and pcDNA3.1-CCAT1 were transfected into the human cervical cancer cells XB1702 by the electroporation method and stable transfected cell line was selected and identified by the G418 method. After 48 h of transplantation, the expression levels of CCAT1 lnRNA were measured by RT-PCR. Cellular proliferation was tested by CCK8 method, and apoptosis were determined by the TUNEL technology. The development of human cervical tumors in the nude mice xenograft model was studied by up-regulating and down-regulating the CCAT1 expression in the cells combined with the X-ray irradiation.ResultsInterference of CCAT1 lnRNA expression in XB1702 cells significantly inhibited the cellular proliferation, increased apoptosis rate, and reduced the average xenografted tumor volume of the nude mice compared with control group. Up-regulation of CCAT1 lnRNA expression significantly increased the cellular proliferation and decreased apoptosis. The average xenograft tumor volume in this group had no obvious difference with the ones before the irradiation.ConclusionDown-regulating CCAT1 mRNA expression levels could inhibit the development of tumor and improve the tumor sensitivity to radiotherapy in nude mice transplanted with human cervical cancer cells XB1702, while up-regulating CCAT1 lnRNA expression levels could enhance the radiation resistance of tumor.

Uterine cervical neoplasms; Neoplasm transplantation; Mice, nude; XB1702 cells; Long non-coding RNA

GAO Jin-ping, Email: gaojinpinglf@163.com

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2017.01.008

Chin Med Biotechnol, 2017, 12(1):40-44

065000 河北省廊坊市安次区医院妇产科（高金苹）；065000河北省廊坊市人民医院化验室（张绍菊）；065000 河北省廊坊市广安医院妇产科（罗志红）；065000 河北省廊坊市中医院放射科（李津）

高金苹，Email：gaojinpinglf@163.com

2016-10-14

www.cmbp.net.cn 中国医药生物技术, 2017, 12(1):40-44

Author Affiliations:Obstetrics and Gynecology, Anci District Hospital Gynecology (GAO Jin-ping), People's Hospital Laboratory (ZHANG Shao-ju), Gynecology of Guang'an City Hospital (LUO Zhi-hong), Radiology of Chinese Medicine Hospital (LI Jin), 065000 Langfang, China

www.cmbp.net.cn