氯胺酮长期滥用后小鼠海马区caspase⁃3和PSD⁃95的表达变化

杜傲，任鹏，2，何柏林，杨顺成，丁润涛，沈瑞鹏，李延柠，董志斌，卢岩，吴旭

（1.中国医科大学法医学院法医病理学教研室，沈阳 110122；2.中国刑警学院法医学系，沈阳 110035；3.沈阳市公安司法鉴定中心，沈阳 110003；4.中国医科大学附属盛京医院卫生部小儿先天畸形重点实验室，沈阳 110004）

·论著·

氯胺酮长期滥用后小鼠海马区caspase⁃3和PSD⁃95的表达变化

杜傲1，任鹏1，2，何柏林1，杨顺成3，丁润涛1，沈瑞鹏1，李延柠1，董志斌1，卢岩4，吴旭1

（1.中国医科大学法医学院法医病理学教研室，沈阳 110122；2.中国刑警学院法医学系，沈阳 110035；3.沈阳市公安司法鉴定中心，沈阳 110003；4.中国医科大学附属盛京医院卫生部小儿先天畸形重点实验室，沈阳 110004）

目的 研究氯胺酮长期滥用模型中海马区半胱氨酸蛋白酶（caspase）3和突触后密度蛋白（PSD）95的表达变化。方法每日小鼠腹腔注射氯胺酮（30 mg/kg）、持续3个月建立小鼠氯胺酮长期滥用模型，采用免疫组化及Western blotting检测小鼠氯胺酮长期滥用后caspase⁃3和PSD⁃95的表达情况。结果 免疫组化结果显示caspase⁃3表达增强，PSD⁃95表达减弱。Western blotting结果显示caspase⁃3活化片段蛋白表达升高，PSD⁃95蛋白表达下降。结论 氯胺酮长期滥用致小鼠脑海马区caspase⁃3表达增加、PSD⁃95表达减弱，这一结果揭示了长期滥用氯胺酮所致神经毒性作用的可能机制。

氯胺酮；半胱氨酸蛋白酶3；突触后密度蛋白95；海马

氯胺酮是非竞争性N⁃甲基⁃D⁃天门冬氨酸（N⁃methyl⁃D⁃aspartate，NMDA）受体拮抗剂，是临床常用的一种静脉全麻药。由于能产生强烈致欣快作用，氯胺酮作为一种新型毒品在全球大肆蔓延，俗称“K粉”。大量研究发现，氯胺酮滥用会引起神经系统症状。2001年至2002年，中国药物依赖性研究所对708例氯胺酮滥用者进行了流行病学调查，有85例发生了不同程度的精神障碍，主要表现为幻觉、抑郁、精神分裂等［1］。2009年，广州市脑科医院物质依赖科王达平等［2］发现在接受认知能力分析的46例氯胺酮滥用者中，40%～50%滥用者出现了认知功能损害。本研究拟建立氯胺酮长期滥用小鼠模型，采用免疫组化和Western blotting方法检测小鼠海马区半胱氨酸蛋白酶3（caspase⁃3）和突触后密度蛋白95（postsynaptic density 95，PSD⁃95）的变化，探讨氯胺酮长期滥用后海马区神经毒性的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

兔抗小鼠caspase⁃3多克隆抗体（美国Santa Cruz公司，sc⁃7148），兔抗小鼠PSD⁃95多克隆抗体（美国Abcam公司，ab18258），小鼠抗人β⁃actin单克隆抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司，A03⁃60BM），兔SP检测试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司，SP⁃9001），小鼠SP检测试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司，SP⁃9002），DAB显色试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司，ZLI⁃9018）等。

1.2 动物模型建立及分组

2月龄健康成年雄性C57BL/6小鼠40只，体质量18～22 g，由中国医科大学实验动物中心提供。小鼠随机分为生理盐水组和氯胺酮组，每组20只。分别根据小鼠所在组，每日同一时间腹腔注射给药（注射药量依公式计算，随体质量变化而变化，30 mg/kg），连续给药3个月。3个月后取材。

1.3 免疫组化染色

取小鼠左半脑，4%多聚甲醛或PBS固定，水洗、脱水、透明，石蜡包埋，制作5 μm厚度连续切片，贴于经多聚赖氨酸处理后的载玻片上，37℃温箱干燥过夜。常规脱蜡、水化，3%H2O2或PBS灭活内源性过氧化物酶后，室温非免疫血清封闭60 min，加入兔抗小鼠caspase⁃3多克隆抗体（1∶500稀释）和兔抗小鼠PSD⁃95多克隆抗体（1∶500稀释）4℃孵育过夜，二抗室温孵育30 min，SP室温30 min，DAB显色25 s，显微镜观察。

1.4 Western blotting检测

取小鼠右半脑海马，进行组织样品提取及cas⁃pase⁃3、PSD⁃95的蛋白定量检测。30 μg总蛋白等量上样，SDS⁃PAGE凝胶电泳后，以湿转至PVDF膜，经5%脱脂奶粉室温封闭2 h后，加入兔抗小鼠多克隆抗体caspase⁃3（1∶500稀释）和兔抗小鼠多克隆抗体PSD⁃95（1∶1 000稀释）4℃孵育过夜。TBST洗膜，加入相应的二抗室温2 h，TBST洗膜后ECL发光。利用Scion Image软件分别检测caspase⁃3、PSD⁃95和β⁃actin蛋白表达的平均光密度值，caspase⁃3用17 000/β⁃actin与32 000/β⁃actin相比，得到17 000蛋白表达相对量。PSD⁃95与β⁃actin相比，得到PSD⁃95蛋白表达相对量。

1.5 统计学分析

采用SPSS 13.0软件进行统计学分析，数据用x±s表示，进行两独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组化染色结果

caspase⁃3在生理盐水组海马神经元中弥漫性表达，阳性物质主要分布于细胞质中（图1A、1C）；氯胺酮组海马神经元阳性物质主要表达于细胞质中，阳性表达增加（图1B、1D）。空白对照以PBS代替一抗，无caspase⁃3表达。PSD⁃95在生理盐水组及氯胺酮组均可见表达，阳性物质于生理盐水组海马神经元胞质及突起中弥漫表达（图2A、2C）；氯胺酮组海马神经元胞质及突起中表达较生理盐水组减弱（图2B、2D）。空白对照以PBS代替一抗，无PSD⁃95表达。

图1 caspase⁃3在小鼠海马区的免疫组化染色结果Fig.1 Immunohistochemistry of caspase⁃3 protein expression in mouse hippocampus

2.2 Western blotting检测结果

以β⁃actin为内参（约为42 000），caspase⁃3及PSD⁃95在生理盐水组和氯胺酮组均有阳性条带。caspase⁃3非活性片段大小为32 000，降解后形成的2条活性片段分别为17 000及12 000。生理盐水组及氯胺酮组均出现2条带，为32 000及17 000，活性片段17 000在氯胺酮组的蛋白表达相对量（0.91± 0.05）较生理盐水组蛋白表达相对量（0.53±0.05）升高（P＜0.05），见图3。

图2 PSD⁃95在小鼠海马区免疫组化染色结果Fig.2 Immunohistochemistry of PSD⁃95 protein expression in mouse hippocampus

图3 caspase⁃3活化片段在生理盐水组和氯胺酮组小鼠海马区表达水平的变化Fig.3 Changes of hippocampal caspase⁃3 activation level in the groups of saline and ketamine

PSD⁃95片段大小为80 000，在生理盐水组及氯胺酮组对应位置均有表达，氯胺酮组PSD⁃95蛋白表达相对量（1.34±0.25）较生理盐水组PSD⁃95蛋白表达相对量（1.75±0.05）降低（P＜0.05），见图4。

图4 PSD⁃95蛋白在生理盐水组和氯胺酮组小鼠海马区表达水平的变化Fig.4 Changes of hippocampal PSD⁃95 protein level in the groups of saline and ketamine

3 讨论

截至2013年底，我国累计登记在册氯胺酮滥用者19万，滥用人数居全球第3位，其中25岁以下青少年所占比例高达62%，氯胺酮已成为对我国青少年影响和危害最大的毒品种类之一［3］。目前研究多为单次或一日多次注射氯胺酮对新生或幼年个体的神经毒性作用。研究［4⁃5］发现，氯胺酮单次注射可引起动物脑神经细胞凋亡，且具有剂量-效应关系。关于氯胺酮长期毒性作用，有研究［6］表明其长期反复作用会引起认知功能的改变。YEUNG等［7］发现，氯胺酮以30 mg/kg剂量连续注射6个月后，小鼠前额叶皮质区过度磷酸化tau的表达水平显著升高。而SUN等［8］发现氯胺酮以30 mg/kg剂量注射6个月不引起前额叶皮质区神经细胞凋亡。本研究拟探讨氯胺酮长期滥用是否会引起与认知功能密切相关的小鼠海马神经细胞凋亡以及突触损害。

caspase⁃3作为细胞凋亡的经典标志物被广泛应用于包括氯胺酮致神经损伤在内的研究中［9⁃10］。培养神经元经氯胺酮处理后呈现了时间依赖性数目减少及凋亡［11］。MAJEWSKI⁃TIEDEKEN等［12］对8～10周龄小鼠注射氯胺酮5次，每次间隔30 min，发现海马CA3区凋亡增加。本研究经Western blotting检测，caspase⁃3活性片段表达量在氯胺酮组较生理盐水组显著升高，差异有统计学意义。经免疫组化染色，氯胺酮组小鼠海马区caspase⁃3表达的神经元较生理盐水组多，且氯胺酮组弥漫性表达较生理盐水组强。说明氯胺酮长期滥用可致海马区神经元凋亡增加。

PSD⁃95是突触标志性蛋白，在维持突触可塑性方面起重要作用，与认知功能关系密切。氯胺酮急性作用的实验［13］表明，氯胺酮会导致PSD⁃95表达下降，影响神经突触功能，引起认知功能障碍。本研究经Western boltting检测，发现PSD⁃95在氯胺酮组小鼠海马区表达较生理盐水组减少，差异有统计学意义。免疫组化见PSD⁃95阳性物质弥漫表达于海马神经元胞质及突起中；氯胺酮组表达较生理盐水组减弱。以上说明氯胺酮长期滥用可致海马区PSD⁃95表达减少。

综上所述，本研究发现氯胺酮长期滥用组小鼠海马区凋亡相关蛋白caspase⁃3活性片段表达增加，突触功能蛋白PSD⁃95表达减少，说明氯胺酮长期滥用可致海马区神经细胞凋亡及突触损害，该变化可能与氯胺酮的神经毒性作用以及对认知功能的影响有关。

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（编辑 于 溪）

Change of Caspase⁃3 and PSD⁃95 Expression in Hippocampus of Mice with Chronic Ketamine Addiction

DU Ao1，REN Peng1，2，HE Bolin1，YANG Shuncheng3，DING Runtao1，SHEN Ruipeng1，LI Yanning1，DONG Zhibin1，LU Yan4，WU Xu1
（1.Department of Forensic Pathology，School of Forensic Medicine，China Medical University，Shenyang 110122，China；2.Department of Forensic Medicine，China Criminal Police College，Shenyang 110035，China；3.Forensic Science Division of Shenyang Municipal Public Security Department，Shenyang 110003，China；4.Key Laboratory of Health Ministry in Congenital Malformation，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

Objective To study the changes of hippocampal caspase⁃3 and PSD⁃95 expression levels in the mice exposed to ketamine 30 mg/（kg·d）for three months.Methods Forty C57BL/6 mice were randomly divided into two groups，and the chronic ketamine addiction model was established by giving mice a three month course of daily intraperitoneal injections of ketamine.Immunohistochemical study and Western blot⁃tingwereappliedtoobservetheexpressionofcaspase⁃3andPSD⁃95protein.Results Thereweremoreexpressionofcaspase⁃3andlessofPSD⁃95 in ketamine group as detected by immuohistochemistry.Western blotting results showed caspase⁃3 active fragment level significantly increased com⁃pared to saline group，but PSD⁃95 protein level was decreased.Conclusion The increased level of caspase⁃3 protein and reduced expression of PSD⁃95 are observed after long⁃term ketamine administration.These findings may provide an evidence for the neurotoxicity in mouse hippocampus of chronic ketamine addition as a recreational drug.

ketamine；caspase⁃3；postsynaptic density 95；hippocampus

R89

A

0258-4646（2017）03-0193-04

10.12007/j.issn.0258⁃4646.2017.03.001

国家自然科学基金（81171032，81100807，81671867）；辽宁省教育厅科学研究一般项目（L2014316）；辽宁省科学技术基金（2015020514）

杜傲（1991-），女，硕士研究生.

吴旭，E-mail：wuxu@mail.cmu.edu.cn

2016-11-04

网络出版时间：