胆维丁乳对酵母多糖致多器官功能衰竭小鼠肝脏的作用

赵晴，娄岩，孙灿，孔娟

（中国医科大学1.附属盛京医院临床营养科，沈阳 110004；2.公共基础学院计算机教研室，沈阳 110122）

胆维丁乳对酵母多糖致多器官功能衰竭小鼠肝脏的作用

赵晴1，娄岩2，孙灿1，孔娟1

（中国医科大学1.附属盛京医院临床营养科，沈阳 110004；2.公共基础学院计算机教研室，沈阳 110122）

目的 研究胆维丁乳对酵母多糖致多器官功能衰竭小鼠肝脏损伤的作用。方法 C57 BL/6源性野生小鼠36只，随机分为阴性对照（CON）组、胆维丁乳（CCE）组、酵母多糖（Z）组、CCE+Z组，每组各9只。CON组及Z组纯水喂养，CCE组及CCE+Z组应用胆维丁乳（20 μL溶于200 mL纯水）避光喂养。14 d后Z组及CCE+Z组酵母多糖（500 mg/kg）腹腔注射。18 h后处死各组小鼠，留肝脏标本行病理组织学检查；检测各组小鼠血清中谷丙转氨酶（ALT）含量；应用Western blotting、实时PCR方法测定各组小鼠肝脏组织白细胞介素6（IL⁃6）、白细胞介素18（IL⁃18）表达。结果 病理组织学显示，CCE+Z组组织损伤较Z组轻，较对照组重。与CON组比较，血清ALT水平Z组、CCE+Z组升高；而CCE组降低，差异均具有统计学意义（均P＜0.05）。IL⁃6、IL⁃18蛋白与mRNA表达结果显示，与CON组及CCE+Z组比较Z组明显升高，差异具有统计学意义（均P＜0.05）。结论 胆维丁乳对酵母多糖致肝脏损伤能够起到一定的保护作用。

胆维丁乳；酵母多糖；细胞因子；肝脏损伤

维生素D是脂溶性维生素中的一种，是人体内必需的营养物质之一。现代医学研究［1］认为维生素D可作为一种激素参与并且调节机体的多种生理功能。维生素D首先在肝脏25⁃羟化酶的作用下转化为25⁃（OH）2D3，再经肾脏的线粒体细胞色素P450氧化酶催化转化为1，25⁃（OH）2D3。1，25⁃（OH）2D3才是有生物活性的，其发挥生物效应需要依赖细胞内特有的维生素D受体介导调节靶基因转录才可实现［2］。维生素D受体存在广泛，它与活化的1，25（OH）2D3结合后调节下游信号系统。近年来，研究发现维生素D在免疫系统的许多通路中亦发挥有益的作用。1，25⁃（OH）2D3发挥作用是通过刺激巨噬细胞来完成，可以帮助启动免疫反应［3］。相关研究［4］也已证实，维生素D缺乏与修复免疫反应有关，能降低白细胞的趋化作用，从而增加感染机会。胆维丁乳（每支含维生素D330万国际单位）是维生素D3与胆固醇的等克分子混合物，其作用与维生素D3相同。作为活性维生素D的前体，具有促进钙、磷吸收利用和骨正常钙化的作用，目前广泛应用于临床婴幼儿维生素D缺乏性佝偻病的治疗。酵母多糖诱导大鼠多器官衰竭模型近年研究中使用比较广泛，腹腔注射酵母多糖混悬液后，可引起补体系统的活性成分、白三烯、前列腺素、溶酶体酶类、活性氧代谢产物等炎症介质广泛释放［5］。由于过度激活补体系统，从而引起全身性炎症反应，进而导致肝脏、肾脏、肺脏等多器官衰竭。

很多临床研究［6⁃8］表明，维生素D与肝脏疾病（自身免疫性肝疾病、非酒精性脂肪性肝疾病、肝炎等）密切相关。本研究在酵母多糖小鼠造模过程中预防性应用胆维丁乳，探讨胆维丁乳在肝脏损伤时的保护作用，为进一步研究维生素D及其信号系统提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

C57 BL/6源性野生小鼠36只，2月龄，体质量25～30 g，室温饲养，饲料为普通动物饲料。随机分为对照（CON）组、胆维丁乳（CCE）组、酵母多糖（Z）组、胆维丁乳+酵母多糖（CCE+Z）组，每组各9只。

1.2 动物模型建立及标本采集

CON组及Z组纯水喂养，CCE组及CCE+Z组应用胆维丁乳（20 μL溶于200 mL纯水）避光喂养。4组小鼠饲养2周后，将酵母多糖（0.1 g）与0.9%氯化钠溶液（2 mL）配制成混悬液，根据JANSEN等［9］方法的基础上加以改进，Z组及CCE+Z组无菌腹腔注射酵母多糖混悬液（500 mg/kg），CON组及CCE组无菌腹腔注射等量的0.9%氯化钠溶液。腹腔注射18 h后，脱颈处死小鼠，经右心室取血，离心后取上清，-20℃冷冻备用。提取肝脏组织，应用OCT复合物包埋，-80℃冰箱冷冻至冰冻切片。苏木精伊红（HE）染色，光镜下观察肝脏组织的病理学变化。

1.3 血清ALT测定

经右心室取血，离心后取上清，检测血清ALT含量，采用Sigma公司试剂盒，货号Catalog Number MAK055，依照说明操作。

1.4 Western blotting检测白细胞介素6（interleukin 6，IL⁃6）及白细胞介素18（interleukin 18，IL⁃18）蛋白表达

将小鼠肝脏组织清洗、称重，按照1 mL组织蛋白裂解液（美国Boston Bioproduct公司）∶300 g组织的比例加入组织蛋白裂解液，用小剪刀剪碎，冰上匀浆3次，95℃加热10 min，12 000 r/min离心3 min，取上清液移至新管，分装-20℃冻存；测定蛋白浓度（美国BioRad公司的蛋白质定量试剂盒）；配置10%分离胶，1 h后配置浓缩胶；依照测定蛋白浓度计算上样体积，上样量为80 μg；室温90 V恒压电泳约2 h，4℃冰盒中60 V恒压转膜2 h；封闭液封闭1 h；4℃孵育一抗过夜；TBST洗膜3次，每次5 min；室温孵育二抗1 h；滴加ECL发光液发光。IL⁃6及IL⁃18为兔多克隆抗体，内参β⁃actin为鼠多克隆抗体，均由美国Santa Cruz公司提供。

1.5 实时PCR测定小鼠肝脏中细胞因子mRNA相对表达

将小鼠肝脏组织提出后，按照试剂说明书用TRizol法提取总RNA。提出的RNA溶于DEPC水，并用逆转录试剂盒，依照说明将RNA反转录成cDNA（采用美国Invitrogen公司的反转录试剂盒）。用实时PCR试剂盒（购自美国Invitrogen公司），依照说明在实时PCR仪上对cDNA扩增并行实时定量分析。检测使用Primer 3.0设计合成特异性引物。引物设计序列如下：IL⁃6，P1，ATAGTCCTTCCTACCCC AATTTCC；P2，CTGACCACAGTGAGGAATGTCCA C。IL⁃18，P1，ACATCCGAAGCAACAAGC；P2，CGA AGTGAGAAGGCAACA。β⁃actin，P1，CACTGTGCC CATCTACGA；P2，GGTCTTTACGGATGTCAACG。

1.6 统计学分析

采用SPSS 11.0软件处理，数据用x±s来表示，采用单因素方差分析进行比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠一般状态的比较

腹腔注射酵母多糖及等量生理盐水后，小鼠出现了不同程度的死亡情况。其中CON组及CCE组存活率为100%，Z组及CCE+Z组小鼠随着时间推移存活率逐渐下降，至18 h处死前，Z组存活率为56%，CCE+Z组存活率为67%。Z组及CCE+Z组小鼠在腹腔注射酵母多糖6 h左右均出现了活动减少，嗜睡，进食、饮水量减少，排便增多，多汗，尿少，呼吸深大等症状，2组症状未见明显差别。CON组及CCE组小鼠一般状态良好。

2.2 各组小鼠肝脏组织损伤程度比较

CON组及CCE组小鼠肝脏红润，大体无肿胀及充血。光镜下可见2组小鼠肝组织中正常结构存在，肝索整齐，肝细胞核圆形居中，核膜清晰无明显改变（图1A、1B）。Z组及CCE+Z组小鼠肝脏大小无明显改变，稍显暗红。光镜下可见Z组肝小叶中央静脉及Ⅲ区肝窦扩张淤血，肝细胞核空泡状，局部可见肝细胞嗜酸性变及点状坏死，并见较多淋巴细胞浸润（图1C）；CCE+Z组病理改变较Z组轻，但比CON组重，肝细胞肿胀、胞质空亮或水样变性，但未见明显灶性坏死（图1D）。

2.3 各组小鼠血清ALT水平比较

图1 各组小鼠肝脏组织损伤程度比较Fig.1 Comparison of liver tissue damage in mice of each group

CON组、CCE组、Z组及CCE+Z组血清ALT水平分别为（37±3.7）U/L、（29±2.9）U/L、（80±8.0）U/L、（40±4.0）U/L。与CON组及CCE+Z组比较Z组明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

2.4 小鼠肝脏组织中IL⁃6、IL⁃18蛋白及mRNA表达结果显示，IL⁃6、IL⁃18在各组的蛋白水平上表

达不同，Z组表达最多，CCE+Z组表达水平相对降低。与CON组及CCE+Z组比较Z组明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。IL⁃6mRNA表达与Z组比较，CCE+Z组明显降低（P＜0.05）；IL⁃18mRNA表达与CON组及CCE+Z组比较，Z组明显升高（P＜0.05）。见表1、图2。可见预防性应用胆维丁乳后，小鼠肝脏组织中的IL⁃6及IL⁃18表达不论是在蛋白水平还是mRNA水平都下降。

表1 各组小鼠肝脏组织中IL⁃6、IL⁃18蛋白及mRNA表达比较Tab.1 Comparison of protein and mRNA expression of IL⁃6 and IL⁃18 in liver tissue of mice in each group

图2 各组小鼠肝脏组织中IL⁃6及IL⁃18蛋白表达Fig.2 IL⁃6 and IL⁃18 protein expression in liver tissue of mice in each group

3 讨论

多器官衰竭是脓毒症晚期的重要死亡原因，近年来已有数十种拮抗致炎因子药物进入临床试验性治疗阶段，但疗效远不如动物实验中显示的效果理想［10］。酵母多糖是近年来应用比较广泛的致多器官衰竭模型药物。它的机制是能够引起无菌性腹膜炎，致使炎症反应迁延失控，过度激活补体系统，调动炎性细胞因子参与免疫应答。且酵母多糖是啤酒酵母菌细胞壁的提取物，不引入外源性细菌和内毒素，可以致严重炎症，而致病原因简单。本研究小鼠腹腔注射大量酵母多糖混悬液6 h后，出现活动迟缓，抖动，被毛湿脏，不喜进食，呼吸状态改变等症状，12 h左右开始出现死亡，可见小鼠的急性损伤涉及肝脏、肾脏、肺脏等多器官，大剂量腹腔注射酵母多糖已致小鼠多器官功能衰竭。结果显示ALT升高、组织病理学发生改变，说明肝脏出现了急性损伤的表现，表明造模成功。

IL⁃6是一种由巨噬细胞、T细胞、成纤维细胞及内皮细胞等多种细胞产生的具有广泛生物学活性的多能单链黏蛋白细胞因子，在正常情况下可调节免疫应答，参与炎症反应，在抗感染防御中起重要作用，病理状态下过度升高可造成机体的病理性损伤［11］。IL⁃18是近年来发现的具有多种调节免疫功能的细胞因子，主要由活化的单核-巨噬细胞Th1细胞、B细胞、NK细胞等分泌、又能促进Th1细胞增殖和Th1型免疫应答、促进TNF⁃α、NO、GH⁃CSF等炎性细胞因子及趋化因子的产生。同时该因子为一种强烈的TNF⁃α诱导因子，而TNF⁃α又通过正反馈通路刺激单核-巨噬细胞大量分泌IL⁃18，加速炎症细胞产生，造成细胞免疫介导的组织炎症性损伤。

本研究结果显示，酵母多糖混悬液行腹腔注射18 h后，纯水喂养的小鼠肝脏组织损伤程度较胆维丁乳溶液喂养的小鼠明显加重，因为酵母多糖腹腔注射后经腹腔中的肠系膜、大小网膜吸收入血进入肠系膜静脉，到达肝脏，首先对肝细胞产生毒性作用，而胆维丁乳在一定程度上可以对这种毒性损伤产生保护作用。肝功能改变在注射酵母多糖后Z组小鼠血ALT明显升高，而CCE+Z组小鼠下降，说明维生素D信号系统有保护肝细胞损伤、抑制白细胞由血液向组织中转移的能力。研究［12］显示酵母多糖是单核细胞和巨噬细胞的强大激活剂，主要作用的靶细胞是巨噬细胞，巨噬细胞与之接触后即分泌大量炎症介质（TNF⁃α、IL⁃1、IL⁃6、IL⁃18等）。大量酵母多糖入血虽然可产生直接的毒性作用，但大部分有害作用是由于巨噬细胞释放的细胞因子介导的炎症反应。本结果显示细胞因子IL⁃6及IL⁃18在Z组表达最多，而CCE+Z组与之比较相对减少，与以往研究结果一致。

既往研究［10］中已表明活性维生素D对内毒素诱导的急性肝损伤存在保护作用，也有大量的研究［13］表明，维生素D具有免疫调节和抗炎等作用，本研究从另一角度证明胆维丁乳对酵母多糖所致多器官衰竭的小鼠肝脏损伤亦存在保护作用，以后将进一步探讨胆维丁乳在此模型中对其他脏器的作用。

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（编辑 武玉欣）

Effect of Cholecalciterol Cholesterol Emulsion on Liver of Zymosan⁃induced Multiple Organ Failure in Mice

ZHAO Qing1，LOU Yan2，SUN Can1，KONG Juan1
（1.Department of Clinical Nutrition，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China；2.Department of Computer，School of Fundamental Sciences，China Medical University，Shenyang 110122，China）

Objective To study the effect of cholecalciterol cholesterol emulsion（CCE）in the zymosan（Z）⁃induced acute hepatic injury.Meth⁃ods A total of 36 C57 BL/6 mice were randomly divided into 4 groups，namely negative control（CON）group，CCE group，Z group and CCE+Z group，respectively.There were 9 mice in each group.Mice from CON group and Z group were fed with pure water.Mice from CCE group and CCE+Z group were fed with cholecalciterol cholesterol emulsion 20 μL dissolved in 200 mL pure water which was kept in darkness.After 14 days，Z group and CCE+Z group were injected with zymosan at a dose of 500 mg/kg.After 18 hours，all the mice in each group were sacrificed.The liver tissues were harvested for histopathological examination.The serum ALT levels were determined.The molecular expression of IL⁃6 and IL⁃18 in liv⁃er tissue of mice were evaluated by Western blotting and real⁃time quantitative PCR method.Results The results of histopathological examination showed that liver tissue damage in CCE+Z group was lighter than that of Z group，and heavier than that of the CON group.Compared to the CON group，Z group had the highest serum ALT level，followed by CCE+Z group，while in Z group was significantly lower than that in CON group（all P＜0.05）.The expression of IL⁃6 and IL⁃18 protein and mRNA showed level of Z group was apparently higher than those of CON group and CCE+ Z group（allP＜0.05）.Conclusion Cholecalciterol cholesterol emulsion can play certain protective effect on zymosan⁃induced liver injury in mice.

cholecalciterol cholesterol emulsion；zymosan；cytokine；hepatic injury

R332

A

0258-4646（2017）03-0197-04

10.12007/j.issn.0258⁃4646.2017.03.002

国家自然科学基金（81170065，81570811）

赵晴（1982-），女，主治医师，硕士.

孔娟，E-mail：kongj1@sj⁃hospital.org

2016-09-02

网络出版时间：