载药胶束改善吉西他滨对胰腺癌的治疗效果

康可歆，李昱骥

（中国医科大学附属第一医院1.老年病科；2.胃肠外科，沈阳 110001）

载药胶束改善吉西他滨对胰腺癌的治疗效果

Drug⁃loaded Micelles Improve the Effect of Gemcitabine in Pancreatic Cancer Treatment

康可歆1，李昱骥2

（中国医科大学附属第一医院1.老年病科；2.胃肠外科，沈阳 110001）

通过合成载吉西他滨普朗尼克⁃α⁃生育酚琥珀酸酯聚合物胶束，证明其可改善吉西他滨对胰腺癌的治疗效果。

载吉西他滨胶束；胰腺癌；治疗效果

胰腺癌的发病率在世界范围内有逐渐增高的趋势［1］，能早期诊断并接受手术的患者不足20%，故药物治疗的作用越来越被临床医生重视。目前胰腺癌的一线化疗方案是以吉西他滨（gemcitabine，GEM）为主体的多药联合治疗，但总体生存期（over rall survival，OS）仅为6.8个月［2］。为了提高药物的治疗作用，改善患者的生存时间，寻找新的治疗方法迫在眉睫。有研究［3］表明，载药胶束可以增加药物在肿瘤细胞中的浓度和存留时间，更好的发挥其细胞毒作用。本研究设计了新的载GEM胶束，探讨其对胰腺癌的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

普朗尼克P123，生育酚琥珀酸酯（tocopherol succinate，TOS）和1⁃（3⁃二甲氨基丙基）⁃3⁃乙基碳二亚胺［1⁃（3⁃Dimethylaminopropyl）⁃3⁃ethylcarbodi⁃imide hydrochloride，EDC］购自西格玛公司（中国）。GEM购自江苏豪森药业股份有限公司。人胰腺癌细胞株PANC⁃1购自中国科学院培养收集细胞库（上海，中国）。PANC⁃1细胞用10%胎牛血清1640培养液培养（HyClone公司，美国），细胞的培养环境为37℃，5%CO2/95%空气。实验小鼠购自中国医科大学实验动物部。

1.2 方法

1.2.1 载GEM胶束的制备：将500 mg P123、76 mg TOS、和108 mg EDC溶解在5 mL的DMSO中。将混合物在氮气环境中连续搅拌40 h。产生的化学聚合物用截留分子量3 000的透析袋透析1周，中途频繁更换蒸馏水，产品进行冷冻干燥。将5 mg碱化的GEM和50 mg P123⁃TOS交联物（P/TOS）溶解于乙腈中且搅拌1 h。然后将以上有机混合物装于透析袋中，用蒸馏水透析12～24 h。将最终收集到的载⁃GEM P/TOS（P/TOS⁃GEM）冷冻干燥。

1.2.2 P/TOS⁃GEM胶束的检测：P/TOS⁃GEM的大小和电荷用马尔文分析仪（英国）用来测量。载药能力（drug loading capacity，DLC）通过光谱学进行评估。简单来说，先将P/TOS⁃GEM（冻干后）溶于蒸馏水中，添加1∶50的甲醇。然后离心、留上清，在紫外可见光谱268 nm波长下测量GEM的数量。DLC使用以下公式进行计算：DLC（%）=（截留的GEM量/纳米颗粒总量）×100。

1.2.3 胶束体外药物释放实验：透析法研究药物释放。首先将冷冻干燥的P/TOS⁃GEM溶解于蒸馏水，浓度为1 mg/mL。取1 mL的胶束分散物加到透析膜（分子量3 500）上，透析膜两端是密封的。将装有分散物的透析膜浸入到装有25 mL释放液的离心管中。磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH7.4）和醋酸盐缓冲溶液（ABS，pH5.0）分别作为释放液。在特殊的时间点，需要对释放液进行等体积的更换。释放到释放液中的药物量使用紫外可见光谱仪在268 nm进行测量。

1.2.4 细胞毒性分析：对游离GEM和P/TOS⁃GEM在HepG2癌细胞中的抗癌效力通过MTT实验进行测定。细胞培养后接种到96孔板上，接种密度为1× 104/孔。细胞贴壁培养20 h后使用不同浓度的药物处理24 h。然后将培养基去除，将细胞用PBS洗涤2次。随后加入溶解于PBS的MTT溶液（20 μL，50 mg/mL），并孵育4 h。去除上清液，使用DMSO（100 μL）提取甲瓒。使用酶标仪测定490 nm波长下的吸光度值。细胞存活率与未经过处理的对照组进行比较。

1.2.5 载瘤小鼠模型的建立：取5周龄小鼠，行右侧齿状面注射PANC⁃1细胞悬液（1×106），当肿瘤体积增大到100 mm3时开始实验。肿瘤体积使用游标卡尺进行测量，肿瘤大小用公式V=a×b2/2计算（a和b分别代表肿瘤的最大和最小直径）。

1.2.6 体内抗肿瘤研究：将小鼠肿瘤模型分成3组，每组8只。其中2组每隔3 d经尾静脉分别注射同等剂量（150 mg/kg）的GEM和P/TOS⁃GEM，共注射3次。第3组为对照组。按时监测小鼠的肿瘤体积和体质量变化。

1.3 统计学分析

采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析。数据用x±s表示，2组数据的检验使用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胶束的大小及载药能力

制备P/TOS⁃GEM胶束的临界胶束浓度（critical micelle concentration，CMC）为27 μg/mL，胶束的平均直径约100 nm。DLC为27.43%±3.22%。

2.2 胶束在酸性的环境下更易释放药物

3组实验分别在不同的pH环境中进行。结果显示，在不同的环境中，GEM的释放速度有着显著区别。见图1。24 h后在pH7.4，pH6.5，pH5.0的环境中，胶束的药物释放率分别为33.7%，48.6%和69.4%。在48 h后，pH7.4的环境下，药物释放率接近不足40%，而在pH5.0的环境下，药物释放率几乎达到100%。结果提示胶束的药物释放率受pH环境的影响比较大，在pH5.0的环境下，胶束有较高的药物释放率。

图1 P/TOS⁃GEM体外释放实验

2.3 P/TOS⁃GEM的细胞毒性较游离GEM更强

采用MTT实验分别检测游离GEM和P/TOS⁃GEM对PANC⁃1细胞的毒性作用。结果显示，无论是游离的GEM还是P/TOS⁃GEM对PANC⁃1细胞的细胞毒作用都呈现出浓度依赖性，见图2。游离GEM的IC50为2.12 μg/mL，而P/TOS⁃GEM的IC50为0.5 μg/mL，提示P/TOS⁃GEM对PANC⁃1细胞有着更强的细胞毒性作用。

图2 游离GEM和P/TOS⁃GEM对PANC⁃1细胞的细胞毒性效应

2.4 P/TOS⁃GEM对肿瘤生长的抑制作用强于游离GEM

对照组肿瘤体积逐渐上升，18 d时达到1 600 mm3，游离GEM和P/TOS⁃GEM均可抑制肿瘤体积增长，其中P/TOS⁃GEM的抑制作用更加明显，18 d时体积仅为700 mm3左右，差异有统计学意义（P＜0.05），见图3。

图3 游离GEM和P/TOS⁃GEM的体内抗肿瘤作用

3 讨论

胰腺癌严重威胁人类健康。因多数患者起病隐匿，诊断时多为中晚期，难以接受根治性手术［4⁃5］，目前5年生存率不足5%［6］。为了改善这一现状，更多科研者的目光逐渐投向药物治疗。目前，治疗胰腺癌的临床一线用药是以GEM为主体构建的，但治疗效果不尽理想。随着纳米技术的进展，有学者［7］主张开发新的纳米系统以提高药物的治疗效果。

本研究采用普郎尼克嵌段共聚物作为GEM的载体。共聚物由作为亲水段的普郎尼克和疏水段的TOS构成，合成的胶束直径在100 nm左右，呈近球形结构。据文献［8］报道，只有直径在200 nm以内的胶束才能凭借其高穿透性和滞留效应到达靶细胞。通过多次实验证实，只有将普郎尼克和TOS聚合后构成的胶束才有较高的药物携带能力，达到了27.43%。而单纯用普郎尼克生成的胶束，其携药能力不足10%，分析原因，可能与交联后TOS作为疏水段，可以增加胶束的稳定性，获得更高的药物携带能力有关［9］。

本研究探讨了P/TOS⁃GEM在不同的pH环境下的药物释放情况，发现其具有pH依赖性药物释放的特点。在模拟血液的环境下（pH7.4），药物的释放速度减缓，提示其可以延长药物在血液系统内存留的时间，这一特点可能与普郎尼克的亲水段具有防污特性有关。而在肿瘤内环境（pH5.0）下，药物会得到充分的释放，可以更充分地发挥作用。尤其是在实验的开始阶段，在任何条件下，药物的释放率都很低，说明胶束系统具有很好的稳定性，药物被安全的包埋在胶束中。

就GEM而言，因为具有低分子量和高通透性的特点，可以更容易地进入肿瘤细胞。但是，随着周围环境中药物浓度的下降，GEM也很容易被泵出肿瘤细胞外，难以持久地发挥作用。而采用胶束作为药物载体之后，胶束在肿瘤细胞内的酸性环境下可以逐渐释放GEM，能够将细胞内药物的浓度维持在一定的水平，减少药物的流失，更能充分发挥药物的抗肿瘤作用。

总之，本研究中合成的载GEM胶束可以增强对胰腺癌细胞的杀伤作用，显著抑制胰腺癌的增长，具有实际的临床意义，为胰腺癌的治疗提供了新的思路。

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［2］CONROY T，DESSEIGNE F，YCHOU M，et al.FOLFIRINOX ver⁃sus gemcitabine for metastasic pancreatic cancer［J］.N Engl J Med，2011，364（19）：1817-1825.DOI：10.1056/NEJMoa1011923.

［3］LI YJ，DONG M，KONG FM，et al.Folate⁃decorated anticancer drug and magnetic nanoparticles encapsulated poly，eric carrier for liver cancer therapeutics［J］.Int J Pharm，2015，15（489）：83-90.DOI：10.1016/j.ijpharm.2015.04.028.

［4］WITKOWSKI ER，SMITH JK，TSENG JF.Outcomes following re⁃section of pancreatic cancer［J］.J Surg Oncol，2013，107（1）：97-103.DOI：10.1002/jso.23267.

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［9］WON YW，YOON SM，SONN CH，et al.Nano self⁃assembly of re⁃combinant human gelatin conjugated with α⁃tocopheryl succinate for Hsp90 inhibitor，17⁃AAG，delivery［J］.ACS Nano，2011，5（5）：3839-3848.DOI：10.1021/nn200173u.

（编辑 于 溪）

R453.9

B

0258-4646（2017）03-0281-03

10.12007/j.issn.0258⁃4646.2017.03.023

康可歆（1978-），女，讲师，本科.

李昱骥，E-mail：liyuji74@163.com

2016-07-11

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