应用血红蛋白释放试验研究红细胞保存液甘露醇腺嘌呤磷酸二氢钠对红细胞的保护作用*

李嘉欣， 解彩霞， 刘瑞刚， 苏 燕

(1.包头医学院生物化学与分子生物学教研室，内蒙古包头 014060； 2.包头医学院第一附属医院)



应用血红蛋白释放试验研究红细胞保存液甘露醇腺嘌呤磷酸二氢钠对红细胞的保护作用*

李嘉欣1， 解彩霞1， 刘瑞刚2， 苏 燕1

(1.包头医学院生物化学与分子生物学教研室，内蒙古包头 014060； 2.包头医学院第一附属医院)

为了研究红细胞保存液甘露醇腺嘌呤磷酸二氢钠(mannitol adenine sodium dihydrogen phosphate,MAP)对红细胞的保护作用，将红细胞悬液分为对照组和MAP组，将对照组加入等体积生理盐水和红细胞悬液，将MAP组加入等体积MAP液和红细胞悬液，4℃保存。取作用不同时间的两组反应液，利用血红蛋白释放试验(hemoglobin releasing test，HRT)比较血红蛋白释放差异，并测定相对溶解度。结果显示，相同时间MAP组的Hb释放量明显弱于对照组，红细胞的相对溶解度也较对照组显著降低。说明红细胞保存液能减弱Hb再释放，降低红细胞破膜率，保护红细胞。

红细胞保存液；血红蛋白释放实验；生理盐水；红细胞悬液

包头医学院血红蛋白研究室于20世纪80年代初创建了淀粉-琼脂糖混合凝胶电泳，用来观察Hb的电泳行为。实验时直接用全血进行电泳观察，无需制备红细胞裂解液，大大提高了研究效率[1]。2007年，血红蛋白研究组在进行1例轻型β-地中海贫血患者的红细胞电泳过程中偶然发现了血红蛋白再释放现象，依此创建了血红蛋白释放试验(hemoglobin release test，HRT)[2]，并将这一技术不断发展，应用于对多种临床病例的研究和抗氧化物维生素C对红细胞膜氧化损伤的保护作用的研究。本研究旨在将HRT应用于研究红细胞保存液对红细胞的持续性保护作用，扩大HRT的适用范围。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1血液标本 40份正常成人新鲜肝素抗凝静脉血，取自包头医学院第一附属医院检验科的健康体检者，4 ℃保存。

1.1.2主要仪器与试剂 全波长多功能酶标仪，美国Thermo公司产品；高速离心机，德国Eppendorf公司产品；水平电泳槽(DYY-III型)和稳压稳流电源(DYY-2C)，北京市六一仪器厂出品；17 cm×17 cm玻璃板等。四氯化碳、淀粉、硼酸、冰醋酸、甲醇、氨基黑等均为国产，分析纯；琼脂糖，西班牙进口分装品；红细胞保存液甘露醇腺嘌呤磷酸二氢钠(mannitol adenine sodium dihydrogen phosphate,MAP)，北京博德桑特输采血器材科技开发中心产品。

1.2方法

1.2.1红细胞悬液和溶血液的制备 按照本室常规方法制备红细胞悬液和溶血液，将红细胞悬液分为两组，每组5份。每日各取2份，将对照组加入等体积生理盐水，MAP组加入等体积MAP液，置于4 ℃保存。取作用2 h、1 d、2 d、3 d、4 d样品检测。

1.2.2血红蛋白释放试验 按照本室常规方法配制淀粉琼脂糖混合凝胶，将各样品红细胞悬液分别吸取10 μL加在10 mm×2 mm滤纸条上，将其插入距玻璃板边缘1.5 cm的凝胶中，置于阴极。第一次120 V电泳65 min，断电5 min，通电继续电泳60 min。泳毕，氨基黑10 B染色过夜，次日，用5 %冰醋酸溶液浸泡至背景无色，观察结果。

1.2.3红细胞相对溶解度测定 将样品经3000 r/min离心5 min，吸取30 μL上清液，用生理盐水稀释10倍，调波长至540 nm处，测定吸光度值。以稀释50倍的溶血液吸光度平均值为参照吸光值，计算相对溶解度。

1.2.4统计学处理 数据采用Graphpad Prism 5.0软件处理，结果用(均数±标准差)表示，用Two-way ANOVA检验分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1红细胞相对溶解度测定

2.1.1参照吸光值 将溶血液稀释50倍，置于540 nm处测得的吸光值是红细胞全部溶解后释放出的Hb的吸光值，取5次测定结果分别为0.622、0.624、0.618、0.626、0.631，取平均值0.624作为参照吸光值。

2.1.2不同作用时间对红细胞膜的影响 选取不同作用时间的MAP组和对照组红细胞悬液，测定相对溶解度。结果显示，MAP组破膜程度与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。对照组随时间增加，破膜程度也依次增强，MAP组破膜程度变化微小，对照组的相对溶解度为MAP组的1.3～1.7倍(图1)。

3 讨论

红细胞中的重要成分Hb作为呼吸载体携带氧气输送至全身各组织,并参与维持酸碱平衡。红细胞无核，主要能量供应依赖于糖酵解。在液态保存过程中的红细胞的损坏主要与Hb与氧的结合能力下降、ATP含量下降、代谢调节作用丧失以及膜表面磷脂酰丝氨酸的暴露有关。1990年日本研发出的红细胞保存液MAP液[3]在原有红细胞保存液的基础上加大了甘露醇的含量，使红细胞膜渗透压和膜抗性增强，减少了因膜破坏发生的溶血，可有效保存红细胞长达42 d[4]。目前MAP液被广泛用于红细胞保存，其成分主要包含甘露醇、葡萄糖、枸橼酸盐、腺嘌呤、磷酸盐等。红细胞在保存前需要洗涤，去除白细胞和血浆蛋白等物质。前期研究结果表明，MAP液洗涤使红细胞pH下降显著，而生理盐水洗涤后红细胞pH下降较前者小，MAP液洗涤效果不如生理盐水效果好。本研究中所用红细胞均为生理盐水洗涤。

红细胞血红蛋白释放试验是将未裂解的完整红细胞悬液加在滤纸片上，置于淀粉-琼脂糖混合凝胶中进行电泳。电泳过程包括通电-断电-再通电，染色后会出现Hb的再释放区带。研究表明再释放的Hb是与红细胞膜结合的Hb，当红细胞膜破损增多时，Hb再释放区带增强。MAP液中的多种成分维持了红细胞代谢的完整性，有效延长了红细胞的寿命，降低溶血率。其中所含的葡萄糖可以为红细胞糖酵解提供原料，使红细胞维持一定浓度的腺苷三磷酸，维持血影蛋白磷酸化,保持了膜的变形能力，减少膜损伤。MAP液中的腺嘌呤可通过红细胞的代谢,生成磷酸丙糖和磷酸果糖,参与糖酵解途径,生成腺苷三磷酸并减少腺苷三磷酸的破坏,降低膜损伤。本研究将HRT应用于红细胞保存液对红细胞的保护作用中，随着保存天数的增多，悬浮于生理盐水中红细胞的Hb再释放量增强显著，而悬浮于MAP液中的Hb再释放没有明显增加，从而有效反映出MAP液降低了红细胞膜的破损，为红细胞保存技术的研究提供了新的方法和依据。

[1] 李嘉欣，苏燕.红细胞血红蛋白释放试验的临床研究进展[J].动物医学进展，2014，35(10):104-107.

[2] 李嘉欣，钱多，解彩霞，等.维生素C对红细胞氧化损伤的保护作用[J].动物医学进展，2016，37(5):60-62.

[3] 孔令宜,赵桂珍,刘凤玲,等.红细胞MAP[J].中国输血杂志，1996，(2):105-107.

[4] Knight JA,Searles DA,Clayton FC.The effect of desferrioxamine on stored erythrocytes:lipid peroxidation,deformability,and morphology[J].Ann Clin Lab Sci,1996,26(4):283-290.

Study of the protective effect of erythrocyte preserve fluid (MAP) on erythrocytes by using hemoglobin release test

LI Jiaxin1, XIE Caixia1, LIU Ruigang2, SU Yan1

(1.DepartmentofBiochemistryandMolecularofBaotouMedicalCollege,Baotou014060,China; 2.TheFirstAffiliatedHospitalofBaotouMedicalCollege,Baotou014030,China)

To study the protective effect of erythrocyte preserve fluid (mannitol adenine sodium dihydrogen phosphate, MAP) on erythrocytes.Methods: Erythrocyte suspension was divided into control group and MAP group, physiological saline added in the control group and the equal volume of MAP added in the MAP group, both of which were kept at 4 ℃. Hemoglobin releasing test (HRT) was adopted to compare the difference of Hb release at different time in the two reaction groups, and to measure the relative solubility.Results:Hb release in the MAP group was significantly less than that in the control group(P<0.05), and the relative solubility of erythrocyte was significantly lower than that in the control group(P<0.01).Conclusion:Erythrocyte preserve fluid can weaken Hb release, reduce the rate of erythrocyte rupture and protect erythrocyte.

Erythrocyte preserve fluid; Hemoglobin release test (HRT); Physiological saline; Erythrocyte suspension

国家自然科学基金项目(81160214)；内蒙古自然科学基金(2016MS0801)；内蒙古自治区高等学校科学研究项目(NJZY14265)；内蒙古卫生厅科技计划项目(2010056)；包头市科技计划项目(2015C2006-16)；秦文斌科技教育基金项目(201309)

苏 燕

2016-05-10)