从唾液中提取脱氧核糖核酸扩增血红蛋白β基因*

杨文杰，韩丽红，秦文斌

(1.包头医学院生物化学教研室，内蒙古包头 014060；2.包头医学院基因诊断研究所；3.包头医学院血红蛋白研究室)



从唾液中提取脱氧核糖核酸扩增血红蛋白β基因*

杨文杰1，韩丽红2,3，秦文斌2,3

(1.包头医学院生物化学教研室，内蒙古包头 014060；2.包头医学院基因诊断研究所；3.包头医学院血红蛋白研究室)

目的：探索一种对人体无害、无痛、操作简便的获取基因组脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)的方法。方法：从唾液中提取基因组DNA，应用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增血红蛋白β基因，采用含溴乙锭的琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物。结果：从唾液中提取基因组DNA能够扩增出血红蛋白β基因。结论：唾液作为获取基因组脱氧核糖核酸的简易来源，取样方法简便、快捷，更适用于疾病研究中大规模群体筛查。

基因组脱氧核糖核酸；聚合酶链式反应；唾液

人的体液携带大量信息，其中血、尿、脑脊液已经广泛运用于检测人体的健康水平和诊断疾病。使用唾液作为检测工具可追溯到上世纪60年代，早期检测缺乏准确性和标准性，随着蛋白质组学及基因组学技术的发展，唾液中重要成分的发现以及唾液收集方法的改进，使得唾液成为疾病检测的工具成为可能。唾液具有取样方便且安全无创伤，可反复采集提取等优点，对疾病的早期诊断、早期治疗及预后监测具有重要的实用价值，并可方便地用于对高危人群的普查筛选[1]。

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，为最常用的分子生物学技术之一。PCR能快速特异扩增任何已知目的基因或DNA片段，并能轻易地将DNA混合物中皮克水平的目的基因大量扩增，从而达到纳克、微克、毫克级的特异性脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)片段。因此，PCR技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。它不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。

本实验应用PCR技术从人群唾液样本中提取基因组DNA，应用PCR技术扩增β珠蛋白基因片段，探索一种对人体无害、无痛、操作简便的获取基因组DNA的方法。

1 材料与方法

1.1标本的采集 嘱样本提供者在提取唾液前30 min内，勿进食、饮水、吸烟或嚼口香糖。在吐唾液之前，放松脸颊，轻揉30 s以产生唾液。向唾液样本采集管中轻轻地吐入口腔内分泌的唾液，收集唾液时应注意尽量避免出现过多的泡沫。

1.2仪器 PCR仪、台式高速离心机、电泳仪、电泳槽、微量移液器、紫外灯检测仪、微波炉。

1.3试剂 裂解液(由包头医学院基因诊断研究所秦文斌教授提供)、10 mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸(pH 8.3)、50 mmol/L氯化钾、2 mmol/L氯化镁,10 mmol/L硫酸铵、4种脱氧核糖核酸各200 μmol/L、10 mg/mL溴乙锭、电泳缓冲液、Taq DNA聚合酶、液体石腊、琼脂糖、去离子水。

1.4方法

1.4.1从唾液中提取基因组DNA 取0.1 mL唾液加入到EP管中，2 000 转/min离心10 min,弃上清。加入裂解液60 μL，剧烈震荡2 min，沸水浴中煮沸10 min，12 000 转/min离心10 min，上清液中即含有基因组DNA。

1.4.2PCR扩增 以血红蛋白β基因为模板自行设计引物，扩增Hbβ基因的400 bpDNA片段。引物l：5’-AAG GAG ACC AAT AGA AAC TGG GC-3’；引物2：5’-TCT CCC CTT CCT ATG ACA TGA AC-3’。向20 μL PCR反应液中加入5 μL模板，反应总体积为25 μL。混匀离心后后加入液体石腊1滴。反应条件为94 ℃预变性2 min；35个循环(94 ℃变性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s)；72 ℃延伸10 min。

1.4.3扩增产物的检测 将凝胶托架两端封闭，水平放置在工作台上，放上梳子。用0.5×电泳缓冲液配制1.5 %琼脂糖凝胶，加热溶解后灌入凝胶板中。待凝胶凝固后，小心拔出梳子。将托架放入电泳槽中，加入0.5×TBE缓冲液，使之没过胶面2 mm，拔出梳子。向PCR产物中加入5 μL载样缓冲液，混匀，取10 μL加入凝胶样品孔中。盖上电泳槽，接通电源，样品端接阴极，电泳15～20 min(电压100 V)。在紫外灯(波长302 nm)下观察电泳结果。

2 结果

从唾液中提取基因组DNA，应用PCR技术能够扩增出血红蛋白β基因。见图1。

3 讨论

唾液中含有丰富的DNA，是样品采集的优质来源。唾液样本采集是一种对人体无害、无痛的获取DNA的方法。该法不会对被收集者造成任何不适，容易被接受，因而能最大限度地扩大基因研究的取样范围，特别适合分子流行病学的大规模人群样本采集。常温下唾液样本DNA可以保存多年，绿色环保，携带方便。唾液作为全身体液的一种，不仅含有多种蛋白质，还含有核糖核酸、DNA、脂肪酸以及各种微生物等。

本实验中利用裂解液从唾液中提取基因组DNA，方法简单，操作简便，用时短，结果好。使用唾液作为诊断体液，具有收集简便、无创、费用低廉等诸多优点。人的体液携带大量蛋白质和遗传物质。近年来，使用血液作为诊断体液，通过高通量生物质谱技术研究疾病蛋白质组学、寻找疾病标志物已经得到广泛研究[2]。应用基因组学和蛋白质组学新手段，对唾液中的蛋白质、核酸、微生物进一步进行研究，有望找到实用的相关诊断和治疗的标志物。随着技术的不断创新和研究的继续深入，可以预见唾液作为检测工具与血液相比具有安全、无创、数量充足、可持续获取等优势，适用于庞大的群体筛查[3]。

[1] 陈嘉昌,张红宇,彭瑾瑜,等.从唾液获取人体DNA的简易方法与应用[J].中山大学学报(医学科学版),2006,27(S2):171-173.

[2] 陈婷,吴补领,高杰,等.口腔微生物宏基因组学总DNA制备的方法学初探[J].临床口腔医学杂志,2011,27(3):144-147.

[3] Loo JA,Yan W,Ramachandran P,et al.Comparative human salivary and plasma proteomes[J].J Dent Res,2010,89(10):1016-1023.

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Amplification of hemoglobin β gene by DNA extracted from saliva

YANG Wenjie1, HAN Lihong2,3, QIN Wenbin2,3

(1.BiochemistryTeachingandResearchSectionofBaotouMedicalCollege,Baotou014040,China;2.GeneticDiagnosisInstituteofBaotouMedicalCollege,Baotou014040,China; 3.HemoglobinLaboratoryofBaotouMedicalCollege,Baotou014040,China)

Objective:To explore a harmless, painless and easily-operated method for genomic deoxyribonucleic acid (DNA). Methods:Genomic DNA was extracted from saliva. Polymerase chain reaction (PCR) was applied to amplify hemoglobin β gene, and the amplification products were identified by agarose gel electrophoresis containing ethidium bromide. Results:The genomic DNA extracted from saliva can amplify the hemoglobin β gene. Conclusion:Saliva is a simple source of genomic DNA. The method is simple and fast, and may be used for screening on a large scale.

Genome deoxyribonucleic acid (DNA); Polymerase chain reaction; Saliva

包头市科技计划项目(2015S2004-8),包头医学院博士科研启动基金项目(BSJJ201605)

秦文斌

2016-06-15)