小麦条锈菌泛肽-核糖体蛋白S27a基因的鉴定与表达分析

2017-01-04成玉林康振生

西北农业学报 2016年12期

关键词：实时荧光定量PCR

庄华,成玉林,康振生

(1.西北农林科技大学植物保护学院/旱区作物逆境生物学国家重点实验室，陕西杨凌 712100;2.西北农林科技大学生命科学学院，陕西杨凌 712100)

小麦条锈菌泛肽-核糖体蛋白S27a基因的鉴定与表达分析

庄华1,成玉林2,康振生1

(1.西北农林科技大学植物保护学院/旱区作物逆境生物学国家重点实验室，陕西杨凌 712100;2.西北农林科技大学生命科学学院，陕西杨凌 712100)

从小麦条锈菌吸器cDNA文库中鉴定到一个泛肽-核糖体蛋白S27a(Ubiquitin-ribosomal protein S27a,UBRS27a)基因，命名为PsUBRS27a。该基因开放阅读框为480 bp，编码包含159个氨基酸残基的蛋白质，其氨基酸序列含有典型的UBRS27a蛋白所具有的ubiquitin 和Ribosomal_S27结构域；序列比对发现UBRS27a蛋白在不同物种中高度保守，但PsUBRS27a蛋白在进化上与柄锈菌属的UBRS27a蛋白亲缘关系最近；种内多态性分析发现PsUBRS27a基因在不同小麦条锈菌菌系中的序列非常保守，无核苷酸变化；实时荧光定量PCR 结果表明，PsUBRS27a基因在条锈菌侵染小麦过程中呈上调表达趋势，高峰期为接种后168 h。关键词泛肽-核糖体蛋白S27a；PsUBRS27a；小麦条锈菌；实时荧光定量PCR；表达谱

泛肽-核糖体蛋白S27a(Ubiquitin-ribosomal protein S27a, UBRPS27a)是泛肽和核糖体蛋白的融合蛋白，其N和C端分别含有一个ubiquitin(UB)结构域和Ribosomal_S27结构域，且两端结构域在不同物种中高度保守[1]。在细胞中, UB的常见功能是参与细胞中蛋白质的选择性降解, 而核糖体蛋白的常见功能是组装成核糖体, 主导细胞中蛋白质的合成。越来越多的证据表明, 许多种核糖体蛋白除组成核糖体、参与蛋白质生物合成之外, 还具有其他功能，如参与复制、转录加工、修复、自体翻译、细胞凋亡调控、以及正常细胞的恶性转化及发育调控等[2-3]。然而，目前对UB和核糖体蛋白在植物病原菌中的作用了解很少。

由小麦条锈菌(Pucciniastriiformisf.sp.tritici)引起的小麦条锈病是农业生产上的一种重要真菌病害。生产上主要利用抗病品种来防治小麦条锈病，但由于小麦抗病品种容易随着条锈菌致病性的不断变异而丧失抗性，导致条锈病持续威胁着全球小麦生产和粮食安全。因此，解析小麦条锈菌的致病及其变异机制对开发新的持久防治小麦条锈病策略具有重要意义[4]。

小麦条锈菌属于担子菌亚门(Basidiomycotina)中的柄锈菌属(Puccinia)。它属于严格的活体营养型病原菌，只能于活的寄主植物上获得营养，进行繁殖和完成生活史。和其他锈菌一样，小麦条锈菌在侵染过程中能够形成高度特化的侵染结构-吸器，通过吸器与寄主植物进行信息和能量的交流，对锈菌的致病性起着关键作用。利用亲和层析法可将锈菌吸器从侵染植物中分离开来，之后将分离得到的吸器进行测序鉴定到锈菌吸器cDNA文库[5-8]，而其中的一些基因被证实为锈菌关键的致病相关基因[9-10]。

本试验从小麦条锈菌吸器cDNA文库中鉴定到一个泛肽-核糖体蛋白S27a基因，并对该基因的序列和转录表达特征进行分析，明确该基因为候选的小麦条锈菌致病基因。研究结果为今后深入探究UBRS27a蛋白在小麦条锈菌致病性中的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料，菌种以及培养条件

供试小麦品种为“水源11”，种植于10 cm的花盆中，放置于16 ℃温室，16 h光照/8 h黑暗条件下培养。小麦条锈菌菌系包括CYR23、CYR29、CYR31、CYR32、CYR33、Su11-4和PK-CDRD，在感病小麦品种“铭贤169”上隔离繁殖。

所用的大肠杆菌菌株JM109由西北农林科技大学植物保护学院植物免疫研究室提供，用LB培养基，37 ℃培养。

小麦条锈菌的接种与繁殖：首先用毛笔涂抹接种法[11]将新鲜的条锈菌夏孢子接种于小麦叶片；接着将接种植株放置于16 ℃黑暗保湿箱保湿24 h；之后将保湿过的接种植株移至16 ℃温室培养14 d后就可开始收集新鲜夏孢子。

1.2 仪器与试剂

Gel DocTMXR凝胶成像系统(Bio-Rad)，7500荧光定量PCR仪(Applied Biosystems)和SW-CY-2FB 超净工作台(苏州净化设备有限公司)等常用仪器。

Biozol试剂(BioFluxTM)，反转录试剂盒(Thermo)，TransStart FastPfu DNA Polymerase (全式金公司)，TaqDNA polymerase (Thermo)，胶回收试剂盒(BioTeke)，pMD19-T Simple (Takara)，pGEM-T Easy(Promega)，质粒小量抽提试剂盒(OMEGA)等常用试剂。

1.3 RNA样品的采集

为了明确基因在小麦条锈菌不同侵染阶段的表达特征，选取新鲜夏孢子、萌发夏孢子以及接种小麦后的一系列时间取样，每个样品用锡箔纸包好，液氮速冻后置于-80 ℃冰箱保存，备用。采用Biozol 试剂(BioFlux)提取样品的RNA，第一链cDNA 的合成按照Invitrogen 公司的M-MLV Reverse Transcriptase 试剂盒操作说明进行，反转录引物采用oligod(T)18。

1.4 序列分析及比对

蛋白的保守结构域用Pfam(http://pfam.xfam.org/)进行预测。其他物种的同源蛋白通过Blastp在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库中比对。进化树分析用MEGA5(http://www.megasoftware.net)软件，多序列用DNAMAN软件比对。

1.5 种内多态性分析

为了分析基因的种内序列多态性，比较其在7个不同小麦条锈菌菌系中的编码区(ORF)序列，包括CYR23、CYR29、CYR31、CYR32、CYR33、Su11-4和PK-CDRD。通过PCR扩增产物测序来得到该基因在这7个小麦条锈菌菌系中的序列。

1.6 实时荧光定量PCR 分析

根据PsUBRS27a的 cDNA 序列，利用Primer Preimer 5.0 设计特异的定量PCR 引物，并选用小麦条锈菌的延伸因子(elongation factor，EF)作为内参(表 1)。实时荧光定量PCR参照Guo等[12]方法。每个反应做3个重复，进行3次生物学重复，采用Delta Delta Ct 法[13]分析试验数据，确定基因的相对表达量。

表1 文中所用引物

2 结果与分析

2.1 PsUBRS27a基因的基本特征

在己构建的小麦条锈菌吸器cDNA文库[8]中获得一个编码潜在UBRPS27a蛋白的cDNA序列-PSTha15J12(GenBank number：GH737195.1)。将该cDNA序列于Broad Institute中的小麦条锈菌基因组(http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/puccinia_group/ Blast.html)中Blastx比对发现，该cDNA所对应的小麦条锈菌基因号为PSTG_01817.1。通过PCR 克隆验证，获得该基因序列全长，与数据库预测的序列一致，命名为PsUBRS27a。PsUBRS27a的开放阅读框为480 bp，编码包含159个氨基酸残基的蛋白质，分析发现其氨基酸序列含有典型的UBRS27a蛋白所具有的ubiquitin 和Ribosomal_S27结构域(图1)。序列比对发现不同物种的UBRS27a蛋白相似度非常高，达85%以上。然而，进化树分析发现PsUBRS27a蛋白在进化上与柄锈菌属的UBRS27a蛋白亲缘关系最近(图2)。

图1 PsUBRS27a蛋白的结构特征

图2 不同物种UBRS27a蛋白的进化树分析

2.2PsUBRS27a基因的种内多态性分析

为了鉴定PsUBRS27a基因的种内序列多态性，在7个不同的小麦条锈菌菌系(CYR23、CYR29、CYR31、CYR32、CYR33、Su11-4和PK-CDRD)中比较它的编码区序列。序列比对发现PsUBRS27a基因在不同小麦条锈菌菌系中的序列非常保守，无核苷酸变化。

2.3PsUBRS27a基因的转录表达特征

接下来用实时荧光定量PCR方法来明确PsUBRS27a基因在小麦条锈菌不同侵染阶段的转录表达特征。和夏孢子阶段相比，PsUBRS27a在条锈菌侵染小麦阶段呈上调表达趋势，其高峰期为接种后168 h(图3)。这些结果表明PsUBRS27a基因在条锈菌侵染寄主小麦中诱导表达，因此有可能对小麦条锈菌的侵染和致病性具有贡献。

3 讨论

泛肽-核糖体蛋白S27a是泛肽和核糖体蛋白的融合蛋白，跟蛋白质的合成与选择性降解密切相关，然而目前关于植物病原菌泛肽-核糖体蛋白S27a的研究是一个空白。在本试验中，通过对小麦条锈菌泛肽-核糖体蛋白S27a基因进行研究，证实泛肽-核糖体蛋白可能在小麦条锈菌致病性中起着重要作用，这填补了植物病原真菌关于泛肽-核糖体蛋白S27a研究的空白，为今后揭示泛肽-核糖体蛋白S27a在病菌致病性中的作用奠定基础。

U.夏孢子 Urediniospores；GU.萌发夏孢子 Germinated urediniospores；18 h～216 h.接种CYR32后18 h～216 h的小麦样品 18 hours-216 hours post inoculation with CYR32 in wheat; 数值代表3次生物学重复试验的平均值±标准误 Values are the average ± SD of three independent experiments.

本研究证实UBRS27a蛋白在不同物种中序列高度保守，之前也有类似文献报道[14]。然而UBRS27a蛋白在不同物种中的功能是否高度保守目前不是很清楚。另外，PsUBRS27a基因被证实在不同小麦条锈菌菌系中序列非常保守，无核苷酸变化。种间和种内序列的高度保守性揭示UBRS27a蛋白在不同生物体(包括小麦条锈菌)中的重要作用。

实时荧光定量PCR试验结果表明，PsUBRS27a基因在条锈菌侵染寄主小麦中诱导表达，且诱导表达倍数很高，最高可达50倍。这表明PsUBRS27a是一个候选的小麦条锈菌致病基因，对小麦条锈菌的侵染和致病性具有重要贡献。考虑到PsUBRS27a从小麦条锈菌吸器cDNA文库中鉴定，且PsUBRS27a的表达高峰期为接种后168 h，而该时期小麦条锈菌吸器大量形成，因此推测PsUBRS27a可能是通过影响吸器发育或功能从而参与小麦条锈菌的侵染和致病性。

今后，将通过多种方法来揭示PsUBRS27a基因在小麦条锈菌致病性中的具体作用，并深入探究其分子作用机制，这为最终解析小麦条锈菌的致病机制，及开发新的持久防治小麦条锈病策略，具有重要意义。

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(责任编辑：郭柏寿 Responsible editor:GUO Baishou)

Identification and Expression Analysis of an Ubiquitin-ribosomal Protein S27a Gene fromPucciniastriiformisf.sp.tritici

ZHUANG Hua1，CHENG Yulin2and KANG Zhensheng1

(1. College of Plant Protection, Northwest A&F University/State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas, Yangling Shaanxi 712100, China；2. College of Life Sciences, Northwest A&F University,Yangling Shaanxi 712100, China)

We identified an ubiquitin-ribosomal protein S27a gene (designatedPsUBRS27a) from the cDNA library of isolated haustoria ofPucciniastriiformisf. sp.tritici(Pst).PsUBRS27ahas an open reading frame of 480 bp that encodes a 159 aa protein whose N terminal and C terminal contain a ubiquitin domain and a ribosomal_S27 domain, respectively. Further sequence alignment revealed thatPsUBRS27aproteins are highly conserved in different organisms, but phylogenetic analysis indicated that thePsUBRS27aprotein is more closely related to UBRS27a proteins fromPucciniagroup. The intra-species polymorphism ofPsUBRS27awas studied and the results indicated thatPsUBRS27awas highly conserved in different Pst isolates and no single-nucleotide polymorphism was observed. qRT-PCR analysis showed that transcript level ofPsUBRS27awas induced in planta during Pst infection and was peaked at 168 hour post-inoculation. This study provides important theoretical basis for further studying of the role of UBRS27a in Pst pathogenicity.

Ubiquitin-ribosomal protein S27a;PsUBRS27a;Pucciniastriiformisf. sp.tritici; qRT-PCR; Expression profile

ZHUANG Hua, female,technician.Research area:immunology.E-mail:zhuanghuaok@nwsuaf.edu.cn

KANG Zhensheng, male,professor.Research area:immunology.E-mail:kangzs@nwsuaf.edu.cn

2016-08-16

2016-10-09

国家“973”计划(2013CB127700)；高等学校学科创新引智计划“111”(B07049)。

庄华，女，实验师，研究方向为植物免疫学。E-mail:zhuanghuaok@nwsuaf.edu.cn

康振生，男，教授，从事植物免疫学研究。E-mail:kangzs@nwsuaf.edu.cn

日期：2016-12-12

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20161212.1114.010.html

S432.1

1004-1389(2016)12-1775-05