乙二醇预处理棉花秸秆糖化条件的优化

苏 霞，王美霞，王延琴，杨伟华，魏守军，周大云，杜双奎

(1.西北农林科技大学 食品科学与工程学院，陕西杨凌 712100；2. 中国农业科学院棉花研究所 棉花生物学国家重点实验室，河南安阳 455000)

乙二醇预处理棉花秸秆糖化条件的优化

苏 霞1，王美霞1，王延琴2，杨伟华2，魏守军2，周大云2，杜双奎1

(1.西北农林科技大学 食品科学与工程学院，陕西杨凌 712100；2. 中国农业科学院棉花研究所 棉花生物学国家重点实验室，河南安阳 455000)

以乙二醇预处理的棉花秸秆为试验材料，以酶解时间、酶解温度、pH、底物质量浓度和纤维素酶浓度为试验因素，设计单因素试验、Box-Behnken试验，考察各因素对还原糖质量分数的影响，优化酶解糖化条件。结果表明，纤维素酶浓度和酶解时间对还原糖质量分数的影响极显著，二者的交互作用对还原糖质量分数有显著影响。还原糖质量分数与纤维素酶浓度、底物质量浓度、酶解时间之间的回归模型有统计学意义，各因素的影响主次顺序为纤维素酶浓度>酶解时间>底物质量浓度。酶解糖化优化条件为纤维素酶浓度90 FPU/g、底物质量浓度47.2 g/L、50 ℃、pH 4.8下糖化72 h，还原糖质量分数高达486.9 mg/g，显著高于原秸秆糖化效果(178.2 mg/g)。

棉花秸秆；乙二醇预处理；酶解糖化

能源是人类赖以生存和发展的物质基础，随着世界经济持续快速的发展，对能源的需求越来越大，寻求一种新型的、清洁的、可持续发展的能源势在必行[1-2]。生物乙醇以其环境友好、原料可再生等优良特性，越来越受到研究者的重视[3]。农作物秸秆是一种重要的可再生生物质资源，世界能源危机和环保意识促使人们认识到秸秆能源化的必要性，利用可再生木质纤维素资源制备燃料乙醇已成为世界各国的研究热点。秸秆生物质的预处理、糖化、乙醇化是突破目前生物质秸秆高效利用的技术瓶颈。棉花秸秆中纤维素质量分数高达32%～46%，半纤维素质量分数为20%～28%，利用其制备燃料乙醇具有非常大的潜力[4]。但纤维素酶的糖化作用受纤维素的结晶度和聚合度、底物的表面积、木质素的阻碍、半纤维素含量、原料粒径、多孔性及细胞壁厚度等因素制约，所以预处理是高效利用秸秆制备燃料乙醇的关键所在[5]。吕学斌等[6]采用响应曲面法优化玉米秸秆酶解条件，结果表明酶浓度57.5 FPU/g、底物质量浓度64.7 g/L、温度48 ℃、pH 4.8、反应时间49 h，还原糖质量分数为463.4 mg/g。张苏江等[7]以棉花秸秆为原料，采用正交设计对酶解工艺条件进行优化，结果表明纤维素酶用量0.5%、温度50 ℃、pH 5.0条件下酶解效果最好。邓辉等[8]以棉花秸秆为原料，对其碱预处理及微波/碱预处理，结果表明碱预处理后木质素、半纤维素分别降低60.42%、35.05%；微波/碱预处理后木质素、半纤维素分别降低61.31%、44.78%。田龙等[9]用丙酸在常压温和条件下预处理小麦秸秆，在最佳工艺条件即料液比 1∶16、粒度40目、丙酸质量浓度900 g/L、催化剂质量浓度 3 g/L、温度70 ℃，处理时间150 min下，纤维素保留率为92.6%，半纤维素和木质素的脱除率分别为98.3%和70.5%。Xiao等[10]用乙二醇作为溶剂对玉米秸秆进行预处理，发现微波辅助加热的作用效果比传统加热作用效果更佳。孙付保等[11]以常见高沸点有机酸、醇对麦草进行预处理，结果表明酸比醇类的预处理作用强；而高沸点醇类在高温预处理麦草时，其酶解率显著高于低温处理。岳军等[12]用乙醇对木糖渣、玉米芯和玉米秸秆进行预处理，结果发现预处理可降低木糖渣的木质素含量，提高纤维素转化率；与木糖渣相比，乙醇更适合用于玉米芯和玉米秸秆酶解前的预处理。秸秆纤维的酶解效果受到纤维素的结晶度和聚合度、底物的表面积、木质素的阻碍、半纤维素含量、原料粒径以及酶浓度、底物质量浓度、温度、pH和酶解时间等影响。本研究以乙二醇预处理的棉花秸秆为试验材料，对预处理的棉花秸秆粉进行酶解糖化，分析纤维素酶解温度、酶解时间、pH、底物质量浓度、酶用量对还原糖质量分数的影响，采用Box-Behnken试验对酶解糖化条件进行优化以提高酶解糖化效率，为后续发酵奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

棉花秸秆由中国农业科学院棉花研究所提供，风干、粉碎，过40目筛，备用。水分7.92%，纤维素34.83%，半纤维素26.74%，木质素18.89%，灰分3.74%。

乙二醇、浓硫酸、浓盐酸、浓硝酸、无水乙醇、苯、柠檬酸、柠檬酸三钠、吐温-80、3,5-二硝基水杨酸、氢氧化钠、丙三醇、酒石酸钾钠、苯酚、无水亚硫酸钠等均为分析纯；葡萄糖为生化试剂；纤维素酶，美国MP公司，活力为160 FPU/g。

1.2 仪器设备

SHA-C型水浴恒温振荡器，常州国华仪器有限公司；PB-10标准pH计，德国赛多利斯公司；UV-1200型紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；HH-S4A恒温水浴锅，北京科伟永兴仪器有限公司；KDC-40低速离心机，科大中佳公司等。

1.3 试验方法

1.3.1 秸秆预处理 取棉花秸秆粉5 g，按液固比20∶1(V∶m)加入90%的乙二醇溶液，并加入0.5%浓盐酸作为催化剂，混匀，在180 ℃油浴下处理2.5 h，抽滤，用蒸馏水将滤渣洗至中性，于60 ℃烘干，得乙二醇预处理秸秆。预处理后棉花秸秆纤维素质量分数为75.65%，木质素质量分数为7.12%。

1.3.2 酶解糖化 取一定量预处理棉花秸秆和未经处理棉花秸秆，按试验设计的底物质量浓度(g/L)和纤维素酶浓度(FPU/g)加入一定量的柠檬酸缓冲液和纤维素酶，并按照m(吐温-80)∶m(底物) =1∶10比例添加吐温-80作为表面活性剂，混匀，控制一定的温度和时间，在140 r/min下进行酶解，待酶解结束后沸水浴10 min灭酶，离心分离得酶水解液，用DNS法测定还原糖质量分数。

单因素试验设计：以酶解时间、酶解温度、pH、底物质量浓度、纤维素酶浓度为试验因素，考察酶解时间1～96 h、酶解温度40～60 ℃、pH 4.4～5.2、底物质量浓度20～100 g/L及酶浓度10～90 FPU/g对酶水解糖液中还原糖质量分数的影响。

Box-Behnken试验设计：在单因素试验的基础上，取酶解温度为50 ℃、pH 4.8，以纤维素酶浓度、底物质量浓度、酶解时间为主要因子，设计Box-Behnken试验，因素水平编码见表1。

表1 因素水平编码

2 结果与分析

2.1 时间对酶解效果的影响

在纤维素酶浓度为50 FPU/g、底物质量浓度60 g/L、pH 4.8、50 ℃酶解糖化，还原糖质量分数随时间的变化规律如图1所示。

由图1可以看出，对预处理秸秆酶解糖化，当酶解时间<48 h时，随着时间的延长，还原糖质量分数呈迅速增大趋势；当酶解时间>48 h时，还原糖质量分数呈现缓慢增长。这是因为初始阶段大量的酶与暴露出的纤维素相互作用，将其水解为还原糖，还原糖质量分数快速增加，但随着时间的延长，暴露在外的纤维素已经基本被水解，反应体系中的副产物会逐渐增多，故还原糖质量分数增长趋于缓慢。对原秸秆酶解糖化，其还原糖质量分数明显较低，这是由于未处理秸秆中的纤维素被木质素、半纤维素紧密包裹难以被酶作用所致[13]。

图1 不同酶解时间的还原糖质量分数

2.2 温度对酶解效果的影响

固定纤维素酶浓度为50 FPU/g、底物质量浓度60 g/L、pH 4.8时酶解48 h，酶解温度对还原糖质量分数的影响如图2所示。由图2可以看出，当酶解温度低于50 ℃时，随着温度的升高，还原糖质量分数呈上升趋势；当酶解温度高于50 ℃时，预处理过的秸秆酶解所得的还原糖质量分数下降明显，而原秸秆酶解所得的还原糖质量分数下降缓慢[14]。这可能与纤维素酶的最适宜温度有关，温度过低会使酶的活性受到抑制，影响化学平衡反应，温度过高会使酶的空间结构遭到破坏而永久失去活性。在任何温度下，预处理后的秸秆糖化效果明显高于未处理秸秆。50 ℃为酶解糖化适宜温度，伦晓中等[15]对经过膨化的玉米秸秆进行酶解糖化也得出了相同的结论。

2.3 pH对酶解效果的影响

在纤维素酶浓度50 FPU/g、底物质量浓度60 g/L， 50 ℃酶解48 h， 体系pH对还原糖质量分数的影响如图3所示。由图3可以看出，预处理秸秆的酶解还原糖质量分数显著高于未处理秸秆。随着pH值酶增大，秸秆酶解的还原糖质量分数呈先增大后减小趋势。pH太高或者太低，不仅会抑制酶解反应，而且会破坏酶分子结构导致酶蛋白失活[16]，故在pH=4.8时具有最大的还原糖质量分数。

图2 不同酶解温度的还原糖质量分数

图3 不同pH的还原糖质量分数

2.4 底物质量浓度对酶解效果的影响

固定纤维素酶浓度50 FPU/g、pH 4.8、50 ℃酶解48 h，还原糖质量分数随着底物质量浓度的变化规律如图4所示。由图4可知，底物质量浓度对秸秆酶解糖化效果有显著影响，适宜的反应底物质量浓度会使酶和底物充分接触，有利于酶解反应平衡。当底物质量浓度为60 g/L时，还原糖质量分数达到最高。当底物质量浓度过低时，可被纤维素酶作用降解的纤维素质量分数低，纤维素酶不能充分发挥作用，因而导致还原糖质量分数低；当底物质量浓度过高时，纤维素原料不能完全涨润，使得不能完全与酶液接触，酶解效果不好。在相同底物质量浓度下，预处理秸秆的酶解糖化效果明显高于未处理秸秆。

2.5 纤维素酶浓度对酶解效果的影响

在底物质量浓度60 g/L、pH 4.8、50 ℃酶解48 h，纤维素酶浓度与还原糖质量分数的关系如图5所示。由图5可以看出，当底物质量浓度一定时，随着纤维素酶浓度的增加，还原糖质量分数呈先快速增加后趋于平缓的趋势。纤维素酶浓度过低使纤维素和半纤维素不能被完全转化，降低还原糖质量分数。当纤维素酶浓度达到一定程度后，底物与酶的结合呈饱和状态，过多的酶会造成不必要的浪费[17]。50 FPU/g纤维素酶浓度为最适宜浓度。预处理秸秆对纤维素酶浓度的影响更加敏感。

对表2试验数据进行多元回归拟合，还原糖质量分数(Y1)对纤维素酶浓度 (X1)、底物质量浓度(X2)、处理时间(X3)的回归模型为：

图4 不同质量浓度底物的还原糖质量分数

由表3回归模型检验可以看出，还原糖质量分数模型概率P为 0.0004<0.05，模型显著，而失拟项概率P为0.0616>0.05，不显著，表明所建回归模型有统计学意义，可用来分析和预测酶解糖化的工艺参数。

2.6 酶解糖化模型的建立与条件优化

2.6.1 回归模型的建立 以纤维素酶浓度、底物质量浓度、酶解时间为试验因素，Box-Behnken试验方案及结果见表2。

图5 不同浓度纤维素酶的还原糖质量分数

表2 试验方案与结果

表3 回归模型和回归系数显著性检验

注：*差异显著(P<0.05)，**差异极显著(P<0.01)。

Note: *significant difference (P<0.05 )，**high significant difference(P<0.01).

回归系数显著性检验结果可知(表3)，一次项X1、X3及二次项X22对还原糖质量分数有极显著影响，交互作用项X1X3对还原糖质量分数有显著影响，其余各项对还原糖质量分数影响均不显著。由模型中X1、X2、X3回归系数绝对值大小可以判定对还原糖质量分数影响的因素主次顺序为X1>X3>X2，即纤维素酶浓度影响最大，酶解时间影响次之，底物质量浓度影响较小。

图6为底物质量浓度取零水平时纤维素酶浓度和酶解时间对还原糖质量分数的影响。由图6可以看出，纤维素酶浓度和酶解时间的交互作用对还原糖质量分数有显著影响(P=0.017 7)，随着纤维素酶浓度的提高，还原糖质量分数呈先快速增加后趋于平缓的趋势；随着酶解时间的增加，还原糖质量分数亦呈现先增加后下降趋势。当纤维素酶浓度较高时，酶解时间对还原糖质量分数的影响较大。当纤维素酶浓度取最高水平，酶解时间取中间水平时，还原糖质量分数有最高值。

2.6.2 优化条件的确定 对回归模型分析得优化工艺条件为X1=1、X2=0.32、X3=1，即酶浓度90 FPU/g、底物质量浓度47.2 g/L、酶解时间72 h时，酶解糖化后还原糖质量分数高达488.7 mg/g。对优化工艺条件进行验证，酶解糖化后酶水解液中还原糖质量分数为486.9 mg/g，与理论预测值无显著差异。在优化条件下对原秸秆进行酶解糖化，还原糖质量分数仅为178.2 mg/g，表明棉花秸秆经乙二醇预处理后，酶解糖化效果得到明显改善。

图6 纤维素酶浓度与酶解时间对还原糖质量分数影响的响应曲面图

3 结 论

乙二醇预处理的棉花秸秆酶解糖化时，纤维素酶浓度和酶解时间对还原糖质量分数的影响极显著，二者的交互作用对还原糖质量分数有显著影响。还原糖质量分数与纤维素酶浓度、底物质量浓度、酶解时间之间的回归模型有统计学意义，各因素对还原糖质量分数的影响主次顺序为纤维素酶浓度>酶解时间>底物质量浓度。乙二醇预处理棉花秸秆酶解糖化优化条件为纤维素酶浓度90 FPU/g、底物质量浓度47.2 g/L、50 ℃、pH4.8下糖化72 h，还原糖量高达486.9 mg/g，远高于原秸秆糖化效果(178.2 mg/g)，乙二醇预处理效果显著。

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(责任编辑：史亚歌 Responsible editor:SHI Yage)

Optimization of Enzymatic Saccharification of Glycol Pretreatment Cotton Stalk

SU Xia1,WANG Meixia1,WANG Yanqin2,YANG Weihua2, WEI Shoujun2,ZHOU Dayun2and DU Shuangkui1

(1.College of Food Science and Engineering,Northwest A&F University,Yangling Shaanxi 712100,China;2.State Key Laboratory of Cotton Biology,Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agriculture Science,Anyang Henan 455000,China)

The enzymatic saccharification parameters of cotton stalk pretreated by ethylene glycol were investigated. The effect of hydrolysis time,hydrolysis temperature,pH,substrate mass concentration,and cellulase concentration on reducing sugar mass fraction was studied by the single factor experiment and Box-Behnken design to optimize enzymatic saccharification conditions. The results indicated that the influence of cellulase concentration and hydrolysis time on reducing sugar mass fraction was highly significant,and the interaction between the two factors had a significant influence on the reducing sugars mass fraction. The model obtained had a statistically significance. The influences on reducing sugars mass fraction followed the order of cellulase concentration>hydrolysis time>substrate concentration. The reducing sugars mass fraction of pretreated cotton stalk was 486.9 mg/g,significantly higher than the native biomass (178.2 mg/g) under the optimized conditions of cellulase concentration 90 FPU/g,substrate concentration 47.2 g/L,hydrolysis time 72 h,hydrolysis temperature 50 ℃ and pH 4.8.

Cotton stalk; Glycol pretreatment; Enzymatic saccharification

SU Xia,female,master student.Research area:comprehensive utilization of straw.E-mail:18700943418@163.com

ZHOU Dayun,female,associate research fellow.Research area:comprehensive utilization of cotton seed quality and byproducts. E-mail:zhoudy@cricaas.com.cn

2015-11-04

2015-12-11

国家棉花产业技术体系项目(CARS-18)；公益性行业(农业)科研专项(201503135)。

苏 霞，女，硕士生，研究方向为秸秆的综合利用。E-mail:18700943418@163.com

周大云，女，副研究员，主要从事棉花种子品质及副产品综合利用研究。E-mail: zhoudy@cricaas.com.cn

日期：2016-12-12

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20161212.1123.044.html

TQ35

A

1004-1389(2016)12-1898-07

Received 2015-11-04 Returned 2015-12-11

Foundation item China Agriculture Research System (No.CARS-18),Special Fund for Agro-scientific Research in the Public Interes(No.201503135).