不同冷冻保护剂对羔羊睾丸组织冷冻效果的影响

朱庆超，郭奇奇，王艳华,2，姜雪梅，方 乾，李 浩，胡建宏

(1．西北农林科技大学 动物科技学院，陕西杨凌 712100；2．拉萨市动物疫病预防控制中心，拉萨 850000)

不同冷冻保护剂对羔羊睾丸组织冷冻效果的影响

朱庆超1，郭奇奇1，王艳华1,2，姜雪梅1，方 乾1，李 浩1，胡建宏1

(1．西北农林科技大学 动物科技学院，陕西杨凌 712100；2．拉萨市动物疫病预防控制中心，拉萨 850000)

为探讨非渗透性冷冻保护剂与渗透性冷冻保护剂配伍对羔羊睾丸组织冷冻效果的影响，以φ=10% DMSO、φ=10% EG、φ=10% DMSO+5 g/L BSA和φ=10% EG+5 g/L BSA为冷冻保护剂，测定冷冻前后羔羊睾丸组织的细胞活率、曲细精管完整率、睾酮浓度、抑制素质量浓度以及碱性磷酸酶(AKP)和酸性磷酸酶(ACP)活性。结果表明，φ=10% DMSO+5 g/L BSA组的细胞活率、曲细精管完整率、睾酮浓度、抑制素的质量浓度及AKP和ACP活性均显著高于其他处理组，但显著低于对照组(新鲜组织)；φ=10% EG+5 g/L BSA组与φ=10% DMSO组的AKP和ACP活性差异不显著，但均显著高于φ=10% EG组。说明φ=10% DMSO中添加5 g/L的BSA能有效改善羔羊睾丸组织的冷冻效果。

羔羊；睾丸组织；冷冻保存；冷冻保护剂

睾丸组织的成功冷冻保存不仅为濒危野生动物[1-2]和优良家畜的生殖能力保存提供有效途径，也为恢复未成年男性癌症患者生殖能力提供新的选择[3]。因此，建立睾丸组织低损伤冷冻保存技术体系具有重要的理论和实践意义。

在冷冻保存过程中，冷冻保护剂对于防止睾丸组织的冷冻损伤发挥重要作用。Yildiz等[4]研究报道，冷冻保护剂的类型对于冷冻并且移植到小鼠体内的睾丸组织的精子发生和类固醇合成具有显著影响。Yang等[5]研究表明，冷冻保护液的成分对于冻后睾丸组织的细胞活率和组织形态具有显著影响。目前使用的睾丸组织冷冻保护剂主要属于渗透性冷冻保护剂，渗透性保护剂多是一些小分子物质，可以透过细胞膜渗透到细胞内，主要包括二甲基亚砜(DMSO)、甘油、乙二醇(EG)等。唐立新等[6]研究表明，用DMSO作低温保护剂对大鼠睾丸组织形态特征的保护效果优于甘油和丙二醇；Yildiz等[4]比较DMSO、EG、丙二醇和甘油对小鼠睾丸的冷冻效果，认为经过DMSO冷冻的睾丸组织移植到小鼠皮下后，其组织成活率、曲细精管完整性以及睾酮浓度均显著高于其他冷冻组。Jahnukainen等[7]研究报道，1.4 mol/L的DMSO能很好地保护恒河猴的睾丸组织；Wyns等[8]研究指出，0.7 mol/L的DMSO能成功保存人的睾丸组织；在猪的睾丸组织冷冻保存过程中，甘油的保护效果优于DMSO和EG[9]。

非渗透性冷冻保护剂多是大分子物质，如糖类和蛋白类，不能渗透到细胞内，对细胞无毒副作用。牛血清白蛋白(BSA)由580多个氨基酸组成，具有复杂的三维分子形状，能与多种细胞代谢产物相结合，是一种常用的非渗透性冷冻保护剂[10]。Naijian等[11]研究报道，10或15 g/L的BSA 能显著提高冻后山羊精子的活率。Lee等[12]研究表明，在冷冻保护液(α-MEM，DMSO，胎牛血清)中添加海藻糖能显著提高睾丸组织中生殖细胞的冷冻效果；王晓英[13]研究认为，在DMSO中添加蔗糖对精原细胞的冷冻保存效果明显优于DMSO和甘油。然而，在渗透性冷冻保护剂中添加BSA对睾丸组织的冷冻效果研究还未见报道。

为研究BSA与渗透性冷冻保护剂配伍对羔羊睾丸组织冷冻效果的影响，本试验以DMSO、EG、DMSO+BSA以及EG+BSA作为冷冻保护剂(DMSO与φ=10% EG，参照洪洁赟等[10]研究方法；BSA质量浓度设为5 g/L，参照Naijian等[11]和洪洁赟等[10]研究方法)，通过测定冷冻前后羔羊睾丸组织的细胞活率、曲细精管完整性、睾酮浓度、抑制素质量浓度、碱性磷酸酶(AKP)和酸性磷酸酶(ACP)活性，分析不同冷冻保护剂对冻后睾丸组织活性的影响，为长期保存雄性动物的生殖能力提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 样品的收集

羔羊的睾丸组织采自陕西富平。采集2月龄左右关中奶山羊的左右两侧睾丸组织(8个)，置于保温杯中，迅速加入预冷(4 ℃)的含有双抗(青霉素-链霉素)的磷酸盐缓冲液(PBS)，2 h内带回实验室。

1.2 羔羊睾丸组织的冷冻与解冻

用酒精棉球擦洗睾丸表面，然后用PBS清洗3次，在超净工作台中去除脂肪垫、微血管、附睾以及白膜等，将生精小管用剪刀剪碎至2～5 mm3，将切碎的睾丸组织块混匀，平均分成5组，1组直接用于测定细胞活率、苦味酸固定和组织培养(新鲜睾丸组织为对照组)，另外4组分别添加4种冷冻保护剂(冷冻保护剂的配制见表1)，经逐步冷冻法(4 ℃ 2 h，-20 ℃ 2 h，-80 ℃ 12 h处理后投入液氮)冷冻保存。睾丸组织冷冻保存1个月后，从液氮罐中取出冻存管，迅速置于37 ℃的水浴锅中复温，直至睾丸组织全部融化。解冻完全后，用PBS清洗3次，彻底洗去冷冻保护剂。

表1 冷冻保护剂的成分

注：BSA为0.05 g/mL，青霉素为10 000 U/mL，链霉素为10 000 μg/mL。

Note: The concentration of BSA, penicillin, and streptomycin were 0.05 g/mL, 10 000 U/mL and 10 000 μg/mL, respectively.

1.3 细胞活率、曲细精管完整率测定

睾丸组织解冻后，经2步酶消化法(IV型胶原酶-胰蛋白酶)获得单细胞悬液，将细胞密度调整至106mL-1，采用台盼蓝拒染法测细胞活率。混合液为V(细胞悬液)∶V(4 g/L的台盼蓝溶液)=9∶1。经台盼蓝染色后，立刻在光学显微镜下计数染成蓝色和未染色细胞，死细胞被染成淡蓝色，而活细胞未染色。活细胞率(%)=活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100%。

解冻后，用苦味酸溶液[V(苦味酸饱和液)∶V(甲醛)∶V(冰乙酸)=15∶4∶1]将睾丸组织固定过夜，用PBS清洗3次，进行常规石蜡包埋(脱水、透明、浸蜡、包埋)，切片(6 μm)，苏木精-伊红染色，最后在显微镜下统计曲细精管完整率。曲细精管完整率(%)=完整曲细精管数/(完整曲细精管数+损伤曲细精管数)×100%。

1.4 睾丸组织的体外培养

将冻后的睾丸组织移入培养皿中，加入含φ=15%的胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL 链霉素的α-MEM，33 ℃、φ=5% CO2无菌培养24 h，收集培养基，-20 ℃冰箱保存，用于测定睾酮浓度和抑制素质量浓度，培养后的睾丸组织用于测定AKP和ACP活性。

1.5 睾酮浓度和抑制素质量浓度测定

采用酶联免疫反应(ELISA)试剂盒检测组织培养基中的睾酮浓度和抑制素质量浓度，严格按照羊睾酮和抑制素试剂盒说明书操作。用酶标仪在450 nm波长下测定睾酮和抑制素的吸光度(OD值)，通过标准曲线计算样品中睾酮浓度(nmol/L)和抑制素质量浓度(ng/L)。

1.6 AKP和ACP活性测定

将培养后的睾丸组织用PBS清洗3次，滤纸吸干水分，称质量，然后加入φ=0.86%的生理盐水(生理盐水的体积∶组织块质量=1∶9)，匀浆，2 000 r/min离心10 min，取上清，用于测定组织中AKP和ACP的活性。AKP和ACP的测定按试剂盒说明书进行，在520 nm下测吸光度(OD值)，单位用U/gprot表示。

1.7 数据分析

每个试验处理重复3次，所有结果均用“平均值±标准差”表示。利用SPSS 17.0进行数据统计分析，采用单因素方差分析进行显著性检验。

2 结果与分析

2.1 不同冷冻保护剂对冻后睾丸组织细胞活率和曲细精管完整性的影响

不同冷冻保护剂下冻后睾丸组织的细胞活率和曲细精管完整率见表2。从表2可以看出，在羔羊睾丸组织中添加DMSO+BSA，解冻后细胞活率和曲细精管完整率显著高于其他冷冻保护剂(P<0.05)，但显著低于对照组(P<0.05)。EG处理组的细胞活率和曲细精管完整率最低，显著低于对照组和其他处理组(P<0.05)。另外，DMSO组和EG+BSA处理组的细胞活率和曲细精管完整率差异不显著(P>0.05)。

2.2 不同冷冻保护剂对冻后睾丸组织中睾酮浓度和抑制素质量浓度的影响

从表3可以看出，DMSO+BSA组的睾酮浓度和抑制素质量浓度显著高于其他冷冻保护剂(P<0.05)，但显著低于对照组(P<0.05)。EG处理组的睾酮浓度和抑制素质量浓度最低，显著低于对照组和其他处理组(P<0.05)。另外，DMSO组的睾酮浓度显著高于EG+BSA组(P<0.05)，但抑制素质量浓度差异不显著(P>0.05)。

表2 不同冷冻保护剂下冻后羔羊睾丸组织的细胞活率和曲细精管完整率

注：同行不同字母表示差异显著(P<0.05)。下同。

Notes: Different letters in the same line mean significant difference atP<0.05.The same as below.

表3 不同冷冻保护剂下冻后睾丸组织的睾酮浓度和抑制素质量浓度

2.3 不同冷冻保护剂对羔羊睾丸组织AKP和ACP活性的影响

从表4可以看出，对照组中AKP和ACP活性显著高于处理组(P<0.05)。在处理组中，DMSO+BSA组的AKP和ACP活性最高，显著高于其他处理组(P<0.05)。DMSO组的AKP和ACP的活性与EG+BSA组差异不显著(P>0.05)，但显著高于EG处理组(P<0.05)。EG处理组的2种酶活性最低。

表4 不同冷冻保护剂下冷冻保存后睾丸组织的AKP和ACP活性

3 讨 论

未成年动物的睾丸组织冷冻保存可以为动物繁殖能力的保存提供一个新的途径。但是，目前关于睾丸组织冷冻保护剂的研究多集中在渗透性冷冻保护剂，而渗透性冷冻保护剂中添加非渗透性冷冻保护剂的研究比较少。BSA是一种低密度蛋白质，经常在精子的冷冻保存过程中添加，并取得显著效果[10, 14]。在本研究中，0.05 g/mL的BSA被分别添加到φ=10% DMSO和φ=10% EG中，旨在研究渗透性冷冻保护剂与非渗透性冷冻保护剂的配伍组合对羔羊睾丸组织冻后活性的影响。结果显示，φ=10% DMSO中添加5 g/L BSA对羔羊睾丸组织的冷冻效果最好，冷冻保存后羔羊睾丸组织的细胞活率、曲细精管完整率、睾酮浓度、抑制素质量浓度以及AKP和ACP活性均显著高于其他冷冻保护剂，与洪洁赟等[10]的研究结果一致。

在冷冻过程中，细胞内会产生冰晶，而冰晶会通过物理损伤如刺破细胞膜，或者化学损伤如引起细胞内外的渗透压变化而损伤细胞。DMSO和EG属于渗透性冷冻保护剂，能够渗透到细胞内，并置换出细胞内部的水分，不仅能够保持细胞内部的渗透压，同时可以减少细胞内外冰晶的形成，进而保护细胞免受损伤[15]。Anchordoguy等[16]研究报道，与EG相比，DMSO的分子质量更低，具有更好的渗透性。洪洁赟等[10]研究表明，牛睾丸组织冷冻保存1周后，DMSO组的AKP和ACP活性显著高于EG组；Yildiz等[4]比较DMSO和EG对小鼠睾丸的冷冻效果，认为经过DMSO冷冻的睾丸组织移植到小鼠皮下后，其组织成活率、曲细精管完整性以及睾酮含量均显著高于EG组，与本研究结果一致。在本研究中，DMSO组的细胞活率、曲细精管完整率、睾酮浓度、抑制素质量浓度以及AKP和ACP活性均高于EG组，可能是由于DMSO的渗透性比EG强，更容易渗透到细胞内，从而减少细胞内冰晶的形成。另外，在冷冻过程中，DMSO可能会通过静电作用来保持细胞膜磷脂的稳定性，减少细胞膜的冷冻损伤[16]。所以，DMSO对羔羊睾丸组织的冷冻保护效果优于EG。

细胞膜的流动性是保持细胞正常生理活性的基础，细胞在冷冻过程中防止冰晶形成后，对细胞膜的保护就显得尤为重要。本研究中，在DMSO中添加5 g/L的BSA起到很好的效果，其冻后的细胞活率、曲细精管完整率、睾酮浓度、抑制素质量浓度以及AKP和ACP活性均显著高于其他冷冻组。Naijian等[11]研究报道，10或15 g/L的BSA能显著提高冻后羊精子活率；昝林森等[14]研究表明，1 g/L的BSA添加量可以显著提高冻后牛精子的活率和质膜完整率，但对顶体完整率无显著影响，与本研究结果相似。白蛋白是血清的主要蛋白质，具有缓冲pH变化、调节渗透压、保护细胞免受机械损伤，携带激素、生长因子、脂溶性维生素、药物、微量元素等作用。Waston[17]认为，BSA可以溶解磷脂使细胞膜具有一定的流动性，减少膜脂在冷冻过程中的损伤，从而增强膜的渗透性，缓解由渗透压变化而造成的细胞膜损伤[18]。机体细胞在应激、缺氧、低温等情况下会产生过多活性氧[19]，能快速直接使其他分子发生氧化，进而使其结构和功能发生改变，最终导致细胞损伤[20]。BSA能清除氧化应激产生的氧化自由基，保护细胞膜免受热应激和脂质过氧化[21]。另外，在睾丸组织平衡过程中(4 ℃)，BSA可能为睾丸组织内的不同细胞提供一些有益成分，例如能量物质或小分子[22]。因此，在渗透性冷冻保护剂中添加BSA显著提高冻后睾丸组织的细胞活率，可能是由于BSA增加细胞膜的流动性，减少细胞的氧化损伤以及在组织平衡过程中为细胞提供一些有益成分。细胞活率的提高必然会加固细胞之间的连接作用，因此，曲细精管完整率也会相应提高。睾酮是血液循环中最主要的雄性激素，主要由睾丸间质细胞分泌，抑制素能特异地作用于垂体，抑制卵泡刺激素的合成和分泌，主要由睾丸的支持细胞分泌。本研究中，DMSO+BSA组的睾酮浓度和抑制素质量浓度均显著高于其他组，说明BSA的添加对睾丸间质细胞和支持细胞具有很好的保护作用，从而提高睾酮浓度和抑制素质量浓度。渗透性冷冻保护剂对细胞或者组织有一定的毒害作用，导致组织或者细胞不能长时间暴露在保护剂中，因为渗透性冷冻保护剂会破坏细胞通路，导致细胞内的酶变性，产生具有毒性的甲醛等[23-24]。AKP的活性在精原细胞和早期发育时期的初级精母细胞较强，与睾丸内生精细胞的分裂活动及葡萄糖向各级生精细胞的转运有关[25]。ACP 主要分布于睾丸支持细胞的胞浆内，是支持细胞溶酶体的特异酶，可使己糖磷酸酯脱磷酸成果糖[26]。本研究中，DMSO组和EG组的AKP和ACP 活性降低，可能是由于渗透性冷冻保护剂的毒性导致AKP和ACP的变性。而DMSO+BSA组的AKP和ACP活性较高，可能是由于DMSO和BSA发生互补和协作效应，降低DMSO的毒性。

4 结 论

本研究结果表明，在φ=10%的DMSO 中添加5 g/L的BSA显著增加羔羊睾丸组织冷冻解冻后的细胞活率、曲细精管完整率、睾酮浓度、抑制素质量浓度以及AKP和ACP活性，说明在渗透性冷冻保护剂中添加BSA能够有效改善睾丸组织的冷冻效果。

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(责任编辑：顾玉兰 Responsible editor:GU Yulan)

Effect of Different Cryoprotectants on Activity of Cryopreserved Lamb Testicular Tissue

ZHU Qingchao1, GUO Qiqi1, WANG Yanhua1,2, JIANG Xuemei1,FANG Qian1, LI Hao1and HU Jianhong1

(1. College of Animal Science and Technology, Northwest A&F University, Yangling Shaanxi 712100, China;2. Animal Disease Prevention and Control Center of Lhasa City,Tibet 850000, China)

In order to research the effects of non-permeating cryoprotectants and permeating cryoprotectants combination on lamb testicular tissue cryopreservation, four cryoprotectants (φ=10% DMSO,φ=10% EG,φ=10% DMSO+5 g/L BSA andφ=10% EG+5 g/L BSA) were used in this experiment. The cell viability, integrity of seminiferous tubule, concentration of testosterone, mass concentration of inhibin, activity of alkaline phosphatase (AKP) and acid phosphatase (ACP) were detected both before and after the cryopreservation of lamb testicular tissue. The result showed that the cell viability, rate of seminiferous tubule integrity, concentration of testosterone, mass concentration of inhibin, activity of AKP and ACP inφ=10% DMSO+5 g/L BSA group were significantly higher than in other frozen-thawed groups, while significantly lower than in control group (fresh tissue). Inφ=10% DMSO group andφ=10% EG+5 g/L BSA group, all the parameters were significantly higher than inφ=10% EG group, and there was no significant difference between these two groups. In conclusion, combining 5 g/L BSA andφ=10% DMSO could improve the cryoprotective effects of lamb testicular tissue.

Lamb; Testicular tissue; Cryopreservation; Cryoprotectant

ZHU Qingchao, male, master student. Research area: animal reproductive and physiological regulation. E-mail: 1040203697@qq.com

HU Jianhong, male, professor,doctoral supervisor. Research area:scientific research on livestock reproductive and physiological regulation. E-mail: hjh19732008@126.com

2016-02-26

2016-05-13

国家绒毛用羊产业技术体系(CARS-40-13)；陕西省科技统筹创新工程计划(2015KTTSNY04-03)。

朱庆超，男，硕士研究生，从事动物生殖生理调控研究。E-mail: 1040203697@qq.com

胡建宏，男，教授，博士生导师，主要从事家畜生殖生理调控研究。E-mail: hjh19732008@126.com

日期：2016-12-12

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20161212.1114.006.html

S814.8

A

1004-1389(2016)12-1762-06

Received 2016-02-26 Returned 2016-05-13

Foundation item Sheep for Cashmere and Wool Industry Technology System (No.CARS-40-13); Shaanxi Science and Technology Co-ordinate Innovation Project (No.2015KTTSNY04-03).