辣椒素预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用的代谢组学研究

张 懿， 朱德生， 王 艳



辣椒素预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用的代谢组学研究

张 懿， 朱德生， 王 艳

目的 研究辣椒素预处理对大鼠局部脑缺血再灌注损伤的保护作用。方法 采用大脑中动脉栓塞方法建立大鼠脑缺血再灌注损伤模型，选用SD大鼠24只，适应1 w后随机分为3组，假手术组(Sham)，模型组(Mod)以及辣椒素预处理组(CAP，0.2 mg/kg)，每组8只，采用气相色谱-质谱法(GC-MS)方法分析各组大鼠脑组织皮质样本，运用主成分分析(PCA) ，偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)，正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)，进行差异化合物筛选和鉴定。结果 OPLS-DA得分图能够较明显的区分各组样本。根据变量重要性投影值(VIP)和载荷图，并结合t检验的P值(P<0.05)来筛选差异表达代谢物。与假手术组大鼠相比，模型组大鼠的皮质代谢谱明显不同，兴奋性氨基酸谷氨酸(P<0.05)、肌醇(P<0.01)等代谢物出现显著增高；花生四烯酸(P<0.01)、异亮氨酸(P<0.001)、甲硫氨酸(P<0.001)、L-半胱氨酸(P<0.001)、天冬氨酸(P<0.05)、苯丙氨酸(P<0.05)等氨基酸、1-磷酸-葡萄糖(P<0.05)、6-磷酸-葡萄糖(P<0.01)等糖代谢物出现显著降低。与模型组大鼠相比，辣椒素预处理组异亮氨酸、甲硫氨酸、L-半胱氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸等氨基酸恢复正常水平，3、5-二羟苯甘氨酸(P<0.001)等代谢物显著增高。结论 代谢组学表明，发生脑缺血再灌注损伤时，皮质内能量代谢、神经递质出现紊乱，辣椒素预处理可能通过改善对缺血脑组织的能量代谢障碍，缓解兴奋性谷氨酸的释放量，改善生物膜的功能对脑缺血再灌注损伤发挥保护作用。气相色谱质谱技术能较为全面地反映生物体在药物干预作用下的代谢状态变化，并能通过代谢物含量的差异推断药物的作用机制，为研究脑缺血损伤机制和治疗脑缺血药物提供了新的思路。

TRPV1； 辣椒素； 脑缺血再灌注损伤； 代谢组学

脑缺血再灌注损伤(Cerebral Ischemia Reperfusion Injury) 是指脑缺血至脑组织坏死前，闭塞的脑血管再通后缺血性脑损伤进一步加重的现象[1]。脑缺血再灌注损伤涉及极其复杂的病理生理过程，主要包括兴奋性氨基酸毒性、细胞内钙超载、能量代谢障碍、氧自由基增多、内皮细胞损伤、凋亡基因激活、炎症反应等多个环节[2～5]。如何防止缺血再灌注损伤，寻找有效的治疗药物及措施，促进脑卒中后中枢神经功能的恢复一直是脑血管病领域的研究热点。

瞬时感受器电位香草酸受体-1(Transient Receptor Potential Vanilloid-1，TRPV1)是配体门控非选择性阳离子通道，能够被各种外因性及内因性的物理及化学刺激所激活，如：热刺激(>43 ℃)、酸性环境(pH<5.9)、内源性大麻素花生四烯酸乙醇胺、炎症因子、激动剂辣椒素(Capsaicin)等[6]。辣椒素是一种营养因子，是辣椒的主要成分，负责辣椒的刺激性成分。作为TRPV1高选择性激动剂，辣椒素激活TRPV1并且在疼痛信息的传递整合[6]、改善血管功能预防心血管疾病[7]、自身免疫性疾病的调制[8]、抑郁症等精神疾病的行为调节[9]等方面发挥重要作用，揭示了辣椒素可能作为治疗疾病的靶标。

代谢组学(Metabonomics)是分析比较组织中和体液中的内源性代谢物、代谢产物的代谢谱的变化，获得生理情况或病理状况下的整体代谢状况，有助于揭示寻找与疾病相关的潜在生物标志物[10]。近年来，代谢组学被广泛应用于心脏疾病[11]、糖尿病[12]、肿瘤[13]等疾病研究，在神经系统疾病领域，也进行了涉及肌萎缩侧索硬化症(ALS)[14]、亨廷顿综合征等运动神经退行性疾病[15]以及多发性硬化(MS)等神经免疫性疾病的代谢组学研究[16]，通过葡萄糖、氨基酸和脂质代谢以及神经递质、核苷酸的变化，免疫反应和抗炎反应，获得代谢谱用于疾病诊断、治疗以及机制研究。目前已有研究表明，辣椒素预处理对缺氧新生大鼠的脑损伤具有血管保护作用，但具体作用机制尚不清楚[17]。同时药物预处理不会造成短暂的缺血损伤，对缺血预适应构成一定的保护作用[18]。因此本研究拟采用大脑中动脉栓塞建立脑缺血再灌注损伤模型，建模前3 h进行辣椒素腹腔注射预处理，利用代谢组学的方法探讨辣椒素预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护及作用机制，为研究脑缺血损伤机制和治疗脑缺血药物寻找新的靶标。

1 材料与方法

1.1 试剂 TRPV1激动剂Capsaicin(CAS#：12084-10MG-F，Sigma，美国)，2，3，5-氯化三苯基四氮唑TTC(Sigma，美国)，L-2-氯苯丙氨酸(上海恒柏生物科技有限公司，中国)，衍生化试剂双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺BSTFA(REGIS Technologies，美国)，多聚甲醛、水合氯醛、氯化钠、甲醇、氯仿等(国药集团化学试剂有限公司，上海)。

1.2 仪器 手术显微镜(镇江中天光学仪器有限责任公司，中国)，显微手术器械套装(无锡医用器材厂)、Milli-Q去离子水制备仪(Millipore，美国)，超低温冰箱(海尔医疗设备，中国)，MCAO栓线(北京沙东生物技术有限公司，中国)，研磨仪(JXFSTPRP-24，上海净信科技有限公司，中国)，气相色谱仪(Agilent 7890A，Agilent，美国)，高通量飞行时间质谱仪(Chroma TOF Pegasus HT，LECO，美国)，Restek Rxi-5Sil MS毛细管柱(J&W Scientific，Folsom，美国)。

1.3 实验动物及处理

1.3.1 实验动物 成年健康雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠48只，SPF级，体重180～220 g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，生产许可证：SCXK(沪)2012-0002。室温25 ℃，自由摄水饮食，本研究的所有程序遵守实验室动物的护理和使用指南。

24只SD雄性成年大鼠随机分为3组：假手术组(Sham，n=8)，模型组(Mod，n=8)、辣椒素预处理组(CAP，n=8)。辣椒素预处理参照前人的研究，将辣椒素溶于1%DMSO中，缺血处理前3 h 以0.2 mg/kg的剂量腹腔注射[18]。缺血后24 h收集大脑组织样本进行TTC染色测量梗死面积和缺血组织(Mod Q 、Cap Q)及缺血对侧组织(Mod D 、Cap D)做GC-MS代谢谱分析。

1.3.2 大鼠大脑中动脉栓塞(Middle Cerebral Artery Occlusion，MCAO) 大脑中动脉闭塞(MCAO)方法是最广泛使用的模拟缺血性脑卒中的理想模型。采用Longa等提出的大脑中动脉闭塞的制作方法并在稍作改进后制作模型[19]。2%水合氯醛腹腔麻醉大鼠(2%，0.2 ml /10 g b.w.)，麻醉后大鼠仰卧位固定，常规碘消毒颈部皮肤，右侧颈部皮肤切口分离右侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA)和动脉分支。采用头端多聚赖氨酸包被处理的栓线(直径0.18±0.02 mm)插入右颈内动脉(MCA)至大脑中动脉近端以阻断大脑中动脉血流。90 min后轻轻拔出栓线恢复大脑中动脉供血实现再灌注。假手术组仅进行血管分离，不进行栓线插入处理。手术过程环境温度保持在(37±0.5)℃，直至动物苏醒送回动物房饲养、观察。

1.3.3 神经功能缺损评分 待大鼠术后完全清醒后进行神经功能缺损评分[20]。神经功能缺损评分系统采用5分制，0分表示无神经系统缺损症状；1分表示左前肢屈曲；2分表示左侧肢体对抗力下降，左前肢屈曲；3分表示向左侧转圈；4分表示不能自发行走，意识丧失。分值越高，说明动物神经功能缺损越严重。术后评分为1-3分示意为造模成功，纳入模型组。

1.4 TTC染色 2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色是测定缺血组织面积的常用方法。大鼠麻醉断头处死，迅速取出脑组织冻存于-20 ℃ 约20 min，由前向后每隔2.0 mm 作冠状切片，将脑组织切成连续的2.0 mm冠状切片，然后浸入2%的TTC的磷酸盐缓冲液(0.2 mol/L，pH 7.4)，37 ℃ 避光水浴30 min，染色后4%多聚甲醛固定24 h，最后将每组脑片排列整齐，数码相机拍照，通过图像分析软件(Image-pro Plus 6.0)对梗死面积进行分析。

1.5 气相-质谱GC-MS

1.5.1 代谢物提取 代谢物的提取过程参照前人对样品预处理的方法[21]。取50 mg大鼠脑组织样品于2 ml离心管中，加入0.4 ml甲醇-氯仿(3∶1，v/v)混合溶液，再加入30 μl /L2氯苯丙氨酸作为内标，漩涡混匀，加入钢珠，55 Hz 5 min研磨处理；然后12000 r/min 低温离心5 min，小心取出约0.4 ml 上清于2 ml进样瓶中，每个样本取约13 μl 于新的2 ml进样瓶中，混匀作为质控样本。

1.5.2 代谢物衍生化 真空浓缩器中干燥提取物约1.5 h后，加入80 μl 甲氧胺盐试剂(甲氧胺盐酸盐，溶于吡啶20 mg/ml)，轻轻混匀后，放入烘箱中37 ℃孵育2 h。

向每个样品中迅速加入100 μl 衍生化试剂双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺BSTFA(含有1% TCMS，v/v)70 ℃孵育1 h，冷却至室温后，混合样品中加入10 μl 饱和脂肪酸甲酯标准混合液FAMEs(溶于氯仿C8-C16：1 mg/ml；C18-C30：0.5 mg/ml)，混匀后以供GC-MS检测。

1.5.3 气相-质谱条件 气相色谱仪安捷伦Agilent 7890A联用高通量飞行时间质谱仪配Restek Rxi-5Sil MS毛细管柱(30 m×250 μm×0.25 μm)。

色谱条件：进样量，1 μl，不分流模式；载气，氦气；前进样口吹扫流速，3 ml/min；柱流速：1 ml/min；柱温，37 ℃保持1 min，以10 ℃每分钟的速率上升至300 ℃，保持10 min；前进样口温度280 ℃。

质谱条件：离子源温度，220 ℃；电离电压，-70 eV；扫描方式，85～600 m/z；扫描速率，20 spectra/s；溶剂延迟，366 s。

1.6 数据处理和模式识别 将标准化处理后的数据包括样品名称、峰值、归一化的峰面积等信息导入SIMCA-P 13.0 软件(Umetrics，Umea，瑞典)进行主成分分析(PCA)、偏最小二乘判别分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)，分析结果用得分图(Score Plot)和载荷图(Loading Plot)表示。得分图可以给出样本在空间上的位置，载荷图给出两类间的代谢物变化。

PCA用来显示原始数据样品的总体分布。PLS-DA用来获得数据(X变量)和其它变量(Y变量，分组信息)之间的相关关系，使用UV格式化处理的数据标度换算方式，对第一，二主成分进行建模分析。对模型的质量用7折交叉验证进行检验，并用交叉验证后得到的分类参数R2X 和Q2(分别代表模型可解释的变量和模型的可预测度)对模型有效性进行评判。此后，通过排列实验随机多次(n=200)改变分类变量Y的排列顺序得到相应不同的随机Q2值对模型有效性做进一步的检验。对PLS-DA模型进行正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)，最大化地凸显模型内部不同组别之间的差异，变量远离原点越远，表明差异贡献越大。我们采用第一主成分的VIP(Variable Importance in the Projection)值(VIP>1)，并结合t检验(t-test)的P值(P<0.05)来筛选差异性表达代谢物，评价辣椒素预处理的干预作用。

2 结 果

2.1 辣椒素预处理后脑梗死面积减少 TRPV1激动剂辣椒素缺血处理前3 h以0.2 mg/kg的剂量腹腔注射，由脑片TTC染色图可以看出(见图1)，辣椒素预处理可以明显降低脑梗死面积(81.88%减少至51.81%)(*P<0.05，#P<0.05)。辣椒素术后处理对梗死面积没有明显影响，与文献报道结果相一致[17](结果未展示)。

2.2 神经功能缺损评分 神经功能缺损评分系统采用五分制。待大鼠术后完全清醒后进行神经功能缺损评分，评分结果表明术后模型组和辣椒素处理组大鼠均出现神经功能缺损症状，两组的功能缺损评分均高于假手术组(*P<0.05)。无论是术后还是术后1 h，辣椒素预处理组神经功能缺损评分均有所下降，术后模型组评分为(3.31±0.48 )与辣椒素预处理组 (3.19±0.40)、术后1 h模型组(2.69±0.60) 与辣椒素预处理组(1.81±0.40)(#P<0.05)，说明辣椒素预处理对大鼠神经功能损伤有一定的改善(见图2)。

2.3 气相-质谱的稳定性 各组大鼠脑组织样本连续注射到气相-质谱仪中，通过统计内标保留时间(Retention Time，RT)检测系统的稳定性，由表1可以看出，内标保留时间标准差为：0.00594，说明系统十分稳定，可保证后续的实验需要。

2.4 大鼠脑组织的代谢谱将假手术组、模型组以及辣椒素预处理组3组大鼠脑组织样本进行衍生化后进样分析，得到GC-MS总离子流图(见图3)，基于NIST质谱数据库，共526个峰被鉴定为内源性代谢物，主要为氨基酸、有机酸、糖类、脂肪酸等物质，这些代谢物参与多种生化过程，特别是在糖代谢、氨基酸代谢、脂质代谢等过程。

2.5 辣椒素预处理对大鼠脑组织的代谢谱的影响 为了对下游数据进行更好的分析，我们对气相色谱-质谱数据进行降噪过滤和间距范围内标归一化方法标准化处理，对标准化处理的数据进行模式识别多变量分析，将样品名称、峰值、归一化的峰面积等信息导入SIMCA-P 13.0 软件进行主成分分析(PCA)、偏最小二乘判别分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)，分析结果用得分图(Score Plot)和载荷图(Loading Plot)表示。

2.5.1 PCA结果 主成分分析PCA用来显示原始数据样品的总体分布，由得分图可以看出，无论是假手术组和模型组还是模型组和辣椒素预处理组，样本点基本可以明显区分，可通过后续的判别分析进一步研究其差异(见图4)。

2.5.2 PLS-DA结果 为了分离更高水平的分类变量，采用PLS-DA获得数据(X变量)和其它变量(Y变量，分组信息)之间的相关关系，使用UV格式化处理的数据标度换算方式，对第一，二主成分进行建模分析。对模型的质量用7折交叉验证进行检验，并用交叉验证后得到的分类参数R2X 和Q2(分别代表模型可解释的变量和模型的可预测度)对模型有效性进行评判。此后，通过排列实验随机多次(n=200)改变分类变量Y的排列顺序得到相应不同的随机Q2值对模型有效性做进一步的检验。模型累积解释率见表2。

由PLA-DA得分图如图5、图6所示(横坐标为第1主成分得分，用t1表示；纵坐标为第2主成分得分，用t2表示)，PLS-DA得分图如图3所示。R2X(即模型的可解释变量，见图5B、6B绿色圆点)及R2Y(即监督模型的解释率，见图5B、6B蓝色矩形)接近1说明PLS-DA模型已经可以很好地解释假手术组与模型组、模型组与辣椒素预处理组两组样本之间的差异(见图5A、图6A)。

2.5.3 OPLS-DA结果 对PLS-DA模型进行正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)，最大化地凸显模型内部不同组别之间的差异，变量远离原点越远，表明差异贡献越大。由图7A可以看出，模型组偏离假手术组较远，表明脑缺血损伤严重；图7B可以看出，辣椒素预处理组与假手术组逐渐接近，表明药物干预后对代谢网络的调节起一定的作用，表明缺血损伤开始恢复。

我们采用第一主成分的VIP(Variable Importance in the Projection)值(VIP>1)，并结合t检验(t-test)的P值(P<0.05)来筛选差异性表达代谢物。各组大鼠脑组织样本鉴定的内源性代谢物(见表3)，与假手术组大鼠相比，模型组大鼠的皮质代谢谱明显不同，兴奋性氨基酸谷氨酸(P<0.05)、肌醇(P<0.01)等代谢物出现显著增高；花生四烯酸(P<0.01)、异亮氨酸(P<0.001)、甲硫氨酸(P<0.001)、L-半胱氨酸(P<0.001)、天冬氨酸(P<0.05)、苯丙氨酸(P<0.05)等氨基酸、1-磷酸-葡萄糖(P<0.05)、6-磷酸-葡萄糖(P<0.01)等糖代谢物出现显著降低。

与模型组大鼠相比，辣椒素预处理组大鼠的皮质代谢谱明显不同，异亮氨酸、蛋氨酸、L-半胱氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸等氨基酸恢复正常水平，2-丁酮酸(P<0.05)、3，5-二羟苯甘氨酸(P<0.001)、肌苷(P<0.01)等代谢物显著增高。

表3 各组大鼠脑组织样本鉴定的差异内源性代谢物

图1 辣椒素预处理对脑梗死体积的影响

图2 辣椒素预处理对大鼠神经功能缺损评分的影响

图3 各组样品的GC-MS总离子流图

图4A 假手术组和模型组代谢物的主成分分析得分图

图4B 模型组和辣椒素预处理组代谢物的主成分分析得分图

图5A 假手术组与模型组的PLS-DA的得分图

图5B 假手术组与模型组的PLS-DA的置换检验图

图6A 模型组与辣椒素预处理组的PLS-DA的得分图

图6B 模型组与辣椒素预处理组的PLS-DA的置换检验图

图7A 假手术组与辣模型组的OPLS-DA的得分图

图7B 模型组与辣椒素预处理组的OPLS-DA的得分图

3 讨 论

脑缺血再灌注损伤涉及一系列复杂的病理生理过程，主要包括能量代谢障碍、兴奋性氨基酸毒性、细胞内钙超载、氧自由基增多、内皮细胞损伤、凋亡基因激活、炎症反应等多个环节[2～5]，各个环节之间相互联系、相互作用，构成一个极为复杂的关系网络，形成级联反应，最终导致细胞的凋亡。

3.1 能量代谢障碍 正常生理条件下，脑组织主要通过葡萄糖有氧氧化途径，在细胞线粒体中产生ATP供能[22]。而脑缺血再灌注时ATP合成减少说明脑组织能量代谢障碍，分析原因可能是：(1)脑缺血导致携带至脑组织的氧气和葡萄糖相应减少，脑组织细胞缺氧，有氧代谢障碍，脑组织为了获得能量，通过葡萄糖无氧酵解途径生成ATP为大脑供能，导致合成ATP减少[23]。(2)ATP的前身物质减少：我们的实验结果表明(见表3)，模型组与对照组相比，包括肌苷(P<0.01)、次黄嘌呤(P<0.05)等ATP的前身物质减少，可能因为在再灌注时前身物质被血流冲洗出去，导致总腺苷酸水平降低。而辣椒素预处理后，肌苷、次黄嘌呤水平恢复正常水平，有文献报道补充外源性肌苷对缺血性脑组织起保护作用，促进神经功能恢复[24]，因此，再灌注后不仅脑组织恢复供血供氧，ATP合成逐渐恢复正常，辣椒素术前3 h预处理通过促进肌苷、次黄嘌呤等ATP合成前体物质表达水平恢复进而促进ATP的合成以保证对脑组织的供能。

3.2 谷氨酸的神经毒性作用 谷氨酸作为中枢神经系统含量最高、分布最广、作用最强的兴奋性神经递质，正常情况下主要存在于神经末梢的突触囊泡内，末梢去极化时释放到突触间隙，作用于突触后膜的特异性受体，完成兴奋性突触传递及其它生理作用。脑缺血后，突触间隙谷氨酸释放增加或再摄取障碍导致其在突触间隙堆积，从而过度兴奋谷氨酸受体导致神经细胞的凋亡[25]。由表3可以看出，模型组与对照组相比，谷氨酸的含量显著增加(P<0.05)，代表大脑有一定程度的损伤。辣椒素预处理后，谷氨酸恢复到正常水平(P>0.05)，表明辣椒素预处理能够缓解从脑中释放谷氨酸的量，对脑缺血损伤有保护作用。

脑缺血后，两类谷氨酸受体被谷氨酸激活：离子通道受体(ionotropic，iGluRs)和代谢型受体(metabotropic，mGluRs)两类，离子通道受体包括：N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)、α-氨基-3 羟基-5 甲基-4 异恶唑受体(AMPAR)和海人藻酸受体(KAR)，后两者称为非NMDA受体。兴奋性谷氨酸神经递质的神经毒性包括两个明显不同的过程：一是激活NMDA受体，直接或间接启动电压敏感性通道，Ca2+大量内流，造成迟发性的神经元变性坏死；二是作用于非NMDA受体，引起Na+、CL-内流，造成神经元急性水肿为特征的急性损伤。代谢型受体包括mGluR1-8共8个亚型，I组受体(mGluR1、mGluR5)激活后通过膜内G蛋白、磷脂酶C，引起三磷酸肌醇IP3和甘油二酯DAG的产生，导致胞内Ca2+的释放。II组受体(mGluR2、mGluR3)和Ⅲ组受体(mGluR4、mGluR6、mGluR7和mGluR8)通过膜内G蛋白、腺苷酸环化酶，抑制cAMP的生成[26]。

目前针对谷氨酸神经毒性作用的神经保护剂多种多样，分别从抑制谷氨酸的合成、释放、提高清除谷氨酸的能力、谷氨酸受体抑制剂(NMDAR抑制剂、AMPAR受体抑制剂、KA受体抑制剂)、mGluR的调节、Na+/H+离子交换泵抑制剂、Ca2+内流抑制剂等角度减少谷氨酸的释放或提高载体对谷氨酸的再摄取能力，起到缺血性脑损伤的神经保护作用[27]。越来越多的研究表明，代谢型受体mGluRs的调制在兴奋性谷氨酸神经毒性作用中发挥重要作用[28～32]，尤其是I组mGluR存在多个药物作用的位点发挥作用。有趣的是，我们的实验结果发现，辣椒素预处理组与模型组相比，3，5-二羟苯甘氨酸(DHPG)的含量显著提高(P<0.05)，DHPG作为代谢型谷氨酸受体mGluR1和mGluR5的选择性激动剂，已有文献表明低剂量3，5-二羟苯甘氨酸预处理对大脑中动脉缺血损伤提供神经保护作用，作用机制可能是通过激活I组mGluR，激活磷脂酶C，引起IP3和DAG的产生，导致胞内Ca2+释放至胞浆抑制NMDA受体的内化从而提供神经保护作用[33]。因此我们推测辣椒素预处理对脑缺血损伤的保护作用机制可能是一方面缓解从脑中释放兴奋性谷氨酸的量，另一方面促进低剂量3，5-二羟苯甘氨酸的表达共同作用提供神经保护作用。

3.3 氧自由基的神经毒性作用 脑缺血后，通过花生四烯酸代谢和黄嘌呤氧化酶系统活化等多个途径产生大量自由基进而对细胞内的蛋白、脂质及核苷酸等成分产生神经毒性作用，造成神经细胞损伤[34]。氧自由基的神经毒性作用可概括为：(1)作用于多价不饱和脂肪酸，发生脂质过氧化；(2)诱导DNA、RNA、多糖和氨基酸等大分子物质交联，交联后的大分子则失去原来的活性或功能降低[35]。由表3可以看出，模型组与对照组相比，多不饱和脂肪酸花生四烯酸的含量显著降低(P<0.01)，由于脑缺血后产生的大量自由基攻击富含不饱和脂肪酸的神经膜与血管，生成脂质过氧化物和氢过氧化物，不饱和脂肪酸的丢失使得细胞结构的完整性破坏，膜的通透性、离子转运、膜屏障功能均受到严重影响，从而导致细胞坏死。

3.4 激活脑内成体神经干细胞NSCs自我修复机制 在脑缺血时，脑内内源性神经干细胞NSCs可以增殖、迁移至损伤部位并分化进行修复。Nochi等人发现，脑缺血时，代谢型谷氨酸受体mGluR5信号通路可以参与神经干细胞的增殖过程[36，37]。因此我们推测，辣椒素预处理后，激活的代谢型谷氨酸受体mGluR5不仅参与清除兴奋性谷氨酸的清除作用，还可能通过参与内源性神经干细胞的增殖加强神经干细胞的活化，对缺血再灌注脑损伤发挥保护作用。

综上，在皮质缺血侧组织中检测到的代谢物，肌苷、次黄嘌呤、谷氨酸、3、5-二羟苯甘氨酸、花生四烯酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、L-半胱氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、1-磷酸-葡萄糖、6-磷酸-葡萄糖为脑缺血再灌注损伤后皮质组织中潜在的标志性代谢物。通过辣椒素预处理可不同程度回调肌苷、次黄嘌呤、花生四烯酸、异亮氨酸、蛋氨酸、L-半胱氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、1-磷酸-葡萄糖、6-磷酸-葡萄糖水平。辣椒素预处理可能是通过改善对缺血脑组织的能量代谢障碍，缓解兴奋性谷氨酸的释放量，增强皮质组织神经元的活性、修复和改善生物膜的功能、促进内源性神经干细胞的增殖对缺血再灌注脑损伤发挥保护作用。气相色谱质谱技术能较为全面地反映生物体在药物干预作用下的代谢状态变化，并能通过代谢物含量的差异推断药物的作用机制，为研究脑缺血损伤机制和治疗脑缺血药物寻找新的靶标。

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Neuroprotective effects of capsaicin pretreatment on ischemic stroke rats revealed by metabolomic approach

ZHANG Yi，ZHU Desheng，WANG Yan.

(Institute of Cerebrovascular Disease，Shanghai 201203，China)

Objective The purpose of this study is to elucidate the neuroprotective effects of capsaicin pretreatment on ischemic stroke rats revealed by GC-MS metabolomicapproach. Methods The establishment of middle cerebral artery occlusion is a ideal method to mimic cerebral ischemia reperfusion injury. Twenty-four adult SD rats were randomly divided into three groups：sham group (Sham)，model group (Mod) and capsaicin pretreatment group (CAP，0.2 mg/Kg). The cerebral cortex tissues were collected using GC-MS metabolomic approach and the screening of differential expressed metabolites were adopted by multivariate statistical analyses including PCA analysis，partial least squares discriminant analysis (PLS-DA) and orthogonal partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA). Results OPLS-DA score plot can obviously distinguish each group and the screening methods of differentially expressed metabolites were according to the VIP value and the loading scatter plot combined with t-test (P<0.05). The analytical results showed that the metabolism spectrum in model group was different from sham group，excitatory amino acid glutamic acid (P<0.05) metabolites were significantly increased while arachidonic acid(P<0.01)and some amino acid such as isoleucine(P<0.001)，methionine(P<0.001)，L-cysteine(P<0.001)，aspartic acid(P<0.05)，phenylalanine(P<0.05) and energy metabolites such as 1-phosphate-glucose(P<0.05)、6-phosphate-glucose(P<0.01)significantly decreased. Compared with model group，the metabolism spectrum of capsaicin pretreatment group represents a distinct metabolism spectrum，inosine，isoleucine，methionine，L-cysteine，aspartic acid，phenylalanine and other amino acids were approaching to normal levels，3，5-dihydroxy phenyl glycine (P<0.001) and other metabolites significantly increased. Conclusion These differentially expressed metabolites are related to the disturbance in energy metabolism，glycometabolism. Capsaicin pretreatment may improve energy metabolism，alleviate the release of excitatory glutamate，improve the biological function of membrane to provide the neuroprotective effects. In summery，GC-MS metabolomic approach can comprehensively reflect the general metabolic changes under the drug intervention and explore the underlying mechanism，which is helpful to further understanding the therapeutical mechanism of cerebral ischemia reperfusion injury.

TRPV1； Capsaicin； Cerebral ischemia reperfusion injury； Metabonomics

1003-2754(2016)11-0987-08

2016-03-15；

2016-09-15

上海市自然科学基金(No. 14ZR1436700)；上海市卫计委科研课题(No. 20144Y0225，No. 201440347)

(上海市脑血管病防治研究所，上海 201203)

王 艳，E-mail：wangyan1997@aliyun.com

R743

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