二氢杨梅素对小鼠局灶性脑缺血再灌注损伤炎症反应的影响

邓之婧， 陈家欢， 黄志明， 黄晓亮， 庞逸敏， 郭 哲， 何 萍



二氢杨梅素对小鼠局灶性脑缺血再灌注损伤炎症反应的影响

邓之婧1， 陈家欢1， 黄志明1， 黄晓亮1， 庞逸敏1， 郭 哲2， 何 萍3

目的 观察二氢杨梅素(dihydromyricetin，DMY) 对小鼠局灶性脑缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)损伤后炎症反应的影响。方法 雄性昆明种小鼠随机分为3组，即假手术组、I/R模型组及DMY(500 mg/kg)组。改良线栓法制备小鼠大脑中动脉阻塞/再灌注(middle cerebral artery occlusion / reperfusion，MCAO/R)局灶性脑缺血(3 h)再灌注(24 h)损伤模型。术前10 d开始灌胃给药，每天1次，并在缺血前1 h及再灌注后12 h各给药1次。再灌注24 h后取脑，免疫组织化学检测小胶质细胞标记物离子钙接头蛋白 (ionized calcium binding adaptor molecule-1，Iba1)和5-脂氧合酶(5-lipoxygenase，5-LOX)表达；ELISA法检测缺血脑组织匀浆炎症因子TNF-α和5-LOX代谢物白三烯B4(leukotrienes B4，LTB4)、半胱氨酰白三烯(cysteinyl leukotrienes，CysLTs)含量。结果 与模型组比较，DMY 500 mg/kg抑制小胶质细胞活化并降低TNF-α水平，降低缺血脑组织5-LOX蛋白表达并减少LTB4与CysLTs的产生(P<0.05或P<0.01)。结论 DMY可减轻局灶性脑I/R损伤炎症反应，与抑制5-LOX有关。

二氢杨梅素； 脑缺血再灌注损伤； 炎症反应； 5-脂氧合酶

炎症反应是缺血性脑损伤的重要病理生理学机制之一，脑缺血损伤后的炎症反应是脑缺血后组织持续损伤的重要原因[1]。5-脂氧合酶(5-lipoxygenase，5-LOX)及其代谢产物白三烯物质如白三烯B4(leukotrienes B4，LTB4)和半胱氨酰白三烯(cysteinyl leukotrienes，CysLTs)在炎症反应介导缺血性脑损伤的过程中起重要作用[2]。本课题组前期研究表明，二氢杨梅素 (Dihydromyricetin，DMY)对小鼠局灶性脑缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)损伤具有保护作用，保护机制与其抗氧化作用有关[3]。本研究观察DMY 对小鼠局灶性脑I/R损伤后5-LOX和炎症反应的影响，以进一步探讨其保护机制。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF级健康雄性昆明种小鼠，体质量25～30 g，由广西医科大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK桂2014-0002。

1.2 主要药品与试剂 DMY(西安开来生物工程有限公司，纯度98.33%，批号K130311)，临用前用0.5%羧甲基纤维素钠配置成50 mgoml-1混悬液；异氟烷(瑞沃德生命科技有限公司，批号217151201)；兔抗鼠5-LOX多克隆抗体(美国Santa Cruz)；兔抗鼠离子钙接头蛋白)(ionized calcium-binding adaptor molecule 1，Iba1)多克隆抗体标记小胶质/巨噬细胞(日本Wako)；SP免疫组织化学二抗试剂盒(北京中杉)；LTB4、CysLTs酶联免疫试剂盒(上海江莱生物)，TNF-α 酶联免疫试剂盒(武汉博士德)。

1.3 主要仪器设备 R580小动物麻醉机(瑞沃德生命科技有限公司)；XTZ-D解剖显微镜(上海光学五厂)；DMR+Q550病理图像分析仪(德国Leica)；酶标仪(Molecular Devices)。

1.4 动物分组与给药 42只小鼠随机分为3组，即假手术组、I/R模型组及DMY(500 mg/kg)组，每组14只。DMY组在造模前10 d持续灌胃50 mg/ml DMY 10 ml/kg，每天1次，并在缺血前1 h及再灌注后12 h各给药1次；I/R模型组和假手术组同期灌胃等体积的0.5%羧甲基纤维素钠。

改良线栓法建立小鼠大脑中动脉阻塞/再灌注(middle cerebral artery occlusion/reperfusion，MCAO/R)局灶性脑I/R损伤模型[4]。异氟烷吸入性麻醉后，分离结扎I/R模型小鼠左颈总动脉，在结扎处上方剪一小口，插入直径0.20～0.23 mm的线栓，轻轻将线栓推进至大脑中动脉起始处，进线距颈总动脉分叉约0.8～0.9 cm，结扎固定栓线。缺血3 h后，再次异氟烷吸入性麻醉，小心拔出栓线并结扎颈总动脉残端，再灌注24 h。假手术组只分离结扎左侧颈总动脉，不插入线栓。

1.5 免疫组织化学检测Iba1与5-LOX蛋白表达 再灌注24 h后，每组选小鼠6只，4%多聚甲醛全身灌注后取脑后固定24 h，取视交叉后1～4 mm脑块进行石蜡包埋，4 μm连续冠状面切片。常规HE染色后，光镜下观察脑组织病理改变；同时按试剂说明书以SP法进行Iba1和5-LOX免疫组织化学染色。在每只小鼠皮质缺血灶随机取4个相互不重叠的400×高倍镜视野，计数其中的阳性产物面积。

1.6 酶联免疫检测缺血脑组织TNF-α和LTB4、CysLTs的含量 再灌注24 h后，每组另取小鼠8只，取小鼠缺血侧脑组织进行匀浆，严格按照试剂盒说明分别测定脑组织匀浆中TNF-α和LTB4、CysLTs的含量。

2 结 果

2.1 DMY对小鼠缺血脑组织小胶质细胞活化的影响 见图1，小鼠脑缺血再灌注24 h后，缺血周边区出现Iba1阳性小胶质细胞。模型组缺血周边区Iba1阳性产物面积(865.15±133.94 μm2/HP)，较假手术组(41.03± 13.48 μm2/HP)明显增多(P<0.01)。与I/R模型组相比，DMY明显降低缺血脑组织Iba1 (618.48±101.57 μm2/HP)的表达(P<0.01)。

2.2 DMY对小鼠缺血脑组织5-LOX表达的影响 见图2，小鼠脑缺血再灌注24 h后，5-LOX阳性产物主要表达在缺血周边区。I/R模型组缺血周边区5-LOX阳性产物面积(1269.28± 214.33 μm2/HP)，比假手术组5-LOX阳性产物面积(28.61± 8.56 μm2oHP-1)显著增高(P<0.01)。与I/R模型组相比，DMY明显降低缺血脑组织5-LOX的表达(634.61±135.56 μm2oHP-1)(P<0.01)。

2.3 DMY对小鼠缺血脑组织TNF-α与LTB4、CysLTs含量的影响 与假手术组比较，I/R模型组小鼠缺血侧脑组织TNF-α与LTB4、CysLTs含量均明显升高(均P<0.01)。与I/R模型组比较，DMY组降低小鼠缺血脑组织TNF-α与LTB4、CysLTs含量(P<0.05或P<0.01)(见表1)。

表1 DMY对脑I/R损伤小鼠缺血脑组织TNF-α与LTB4、CysLTs含量的影响

与假手术组比较，##P<0.01；与I/R模型组比较，*P<0.05，**P<0.01

图1 小鼠缺血脑组织Iba1表达(×400)

图2 小鼠缺血脑组织5-LOX表达(×400)

3 讨 论

二氢杨梅素是我国广西和湖南省的壮族、瑶族民间习用草药藤茶的主要黄酮类成分，含量高达27%左右，具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎等多种药理活性，且毒性小，近年来引起国内外学者的极大关注[5]。本课题组前期研究表明，DMY 500 mg/kg降低小鼠局灶性脑I/R损伤后神经功能损伤缺损评分、脑梗死体积和脑含水量，对局灶性脑I/R损伤具有保护作用[3]。

脑I/R损伤是一个复杂的级联反应过程，涉及多种机制，其中脑损伤后炎症反应在缺血性脑卒中的发生和发展过程中具关键作用，抗炎治疗能有效减轻缺血性脑损伤，并有较宽的时间治疗窗[1]。脑缺血损伤后有大量炎性细胞因子表达和炎性细胞浸润，引起一系列炎症反应，其过度表达可加重脑组织损伤。小胶质细胞是脑内主要的炎症效应细胞，在正常脑组织中处于休眠状态，脑缺血发生后，小胶质细胞迅速活化增殖，活化的小胶质细胞可分泌细胞毒性分子如一氧化氮、活性氧和促炎因子如TNF-a和IL-1β等，引起神经元损伤[6]。本研究中，DMY500 mg/kg可抑制小鼠缺血脑组织小胶质细胞活化并减少TNF-a产生，表明DMY对局灶性脑I/R损伤后炎症反应具有抑制作用。

5-LOX是催化花生四烯酸(Arachidonic acid，AA)代谢生成白三烯的关键酶。白三烯是重要的炎症介质，在脑缺血、脑外伤等中枢神经系统损伤性疾病中起重要作用。其中，LTB4是目前发现的最强的白细胞趋化因子和化学激动因子，使血管通透性增高，血浆渗出，并使白细胞向炎症区聚集，介导脑缺血部位的炎性反应；LTB4 还可刺激单核/巨噬细胞和淋巴细胞合成和释放IL-1β、TNF-α和IL-5等细胞因子，进一步激活炎症反应[2]。CysLTs是很强的炎症介质，介导平滑肌痉挛、微血管渗漏等，增加血脑屏障通透性和促进脑水肿形成。多种5-LOX抑制剂(如AA861、去甲二氢愈创木酸NDGA、齐留通、米诺环素、咖啡酸等)[7～10]等对缺血性脑损伤具有保护作用。研究报道DMY能显著抑制由蛋白胨引起的腹腔炎症大、小鼠中性粒细胞释放LTB4及LTC4[11]。本研究中，脑I/R损伤导致缺血脑组织5-LOX表达及其代谢产物LTB4与CysLTs明显增加；DMY 500 mg/kg可抑制缺血脑组织5-LOX表达并减少其代谢产物的产生，对缺血脑组织5-LOX具有抑制作用。

综上所述，DMY可减轻局灶性脑I/R损伤后炎症反应，其抗炎机制与抑制5-LOX、减少5-LOX代谢产物有关。DMY作为一种高效、低毒、价格低廉的中药活性成分，有望成为新型的抗缺血性脑血管病的药物。

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Dihydromyricetin Reduces Inflammatory Reaction Induced by Focal Cerebral Ischemia-Reperfusion Injury in Mice

DENG Zhijing，CHENG Jiahuan，HUANG Zhiming，et al.

(Pharmaceutical College of Guangxi Medical University，Nanning 530021，China)

Objective To study the influences of dihydromyricetin (DMY) on inflammatory reaction induced by focal cerebral ischemia-reperfusion (I/R) injury in mice. Methods Male Kunming mice were randomly divided into 3 groups：sham group，I/R group and DMY 500 mg/kg group. Mice model of middle cerebral artery occlusion (MCAO，3 h)/reperfusion (24 h) model was established by the improved intraluminal filament technique. Drugs were given orally 10 d(once a day)before the surgery，1 h before ischemia and 12 h after reperfusion. After reperfusion for 24 h，the expressions of ionized calcium binding adaptor molecule-1(Iba1) and 5-LOX in mice brain were assessed by immunohistochemistry；the contents of TNF-αand 5-LOX metabolites (LTB4 and CysLTs ) in ischemic brain tissue were detected by ELISA. Results Compared with the I/R group，DMY at 500 mg/kg could obviously inhibit the activation of microglia，lower the level of TNF-α，and reduce the expression of 5-LOX and the production of LTB4 and CysLTs (P<0.05或P<0.01). Conclusion DMY reduces inflammatory reaction induced by focal cerebral I/R injury，which might be associated with its inhibition on 5-LOX.

Dihydromyricetin； Cerebral ischemia-reperfusion injury； Inflammatory reaction； 5-Lipoxygenase

1003-2754(2016)11-0973-03

2016-07-20；

2016-09-17

国家自然科学基金(No. 81360056)；广西自然科学基金面上项目(No. 2013GXNSFAA019147)；广西自然科学基金回国基金项目(No. 2012GXNSFCA053005)；南宁市科学研究与技术开发计划(No. 20153105)

(1.广西医科大学药学院，广西 南宁 530021；2.广西医科大学第三附属医院，广西 南宁 530021；3.广西医科大学实验动物中心，广西 南宁 530021)

郭 哲，E-mail：guozhe2301@163.com；何 萍，E-mail：hpnngxmu@163.com

R966；R743

A