一株罕见手感染克罗彭斯特诺卡菌的鉴定

周世娟

广东省惠东县人民医院，广东惠东 516300

一株罕见手感染克罗彭斯特诺卡菌的鉴定

周世娟

广东省惠东县人民医院，广东惠东 516300

目的 探讨如何鉴定一株罕见克罗彭斯特菌诺卡菌的鉴定方法。 方法 将一株从患者手分离出来的菌株，采用细菌形态学观察、菌落生化特性分析、遗传学分析（如质谱技术、16S rRNA基因扩增后做靶向DNA测序）等相结合的方法进行鉴定。 结果 临床分离的该罕见菌通过镜下菌体典型特征（革兰染色呈90°分枝角G+分枝菌丝，改良Kinyoun染色为阳性）；在血平板、巧克力平板生长缓慢，菌落细小，时间延长起皱褶；触酶阳性，分解葡萄糖、七叶苷、尿素酶，不分解甘露醇、肌醇、明胶；经16S rRNA基因扩增后做靶向DNA测序等综合分析，最后鉴定为克罗彭斯特诺卡菌（Norcardia Kroppenstedtii)。 结论 各实验室可依据细菌形态学特征、菌落生化特性结合遗传学分析(如16S rRNA基因扩增后进行靶向DNA测序）鉴定诺卡菌属，可及时、准确鉴定出克罗彭斯特诺卡菌这类生长缓慢、罕见菌种。

16SrRNA；测序；克罗彭斯特诺卡菌

诺卡菌（Norcardia）在自然界分布广泛，多为腐生寄生菌，近年来诺卡菌病呈上升趋势，主要引起肺部疾病、血流感染、皮肤感染及全身播散性感染，临床病症复杂多样[1]。临床患者感染较常见分离到星形诺卡菌（Norcardia asteroids）和巴西诺卡菌（Norcardia.Brasiliensis），而克罗彭斯特诺卡菌（Norcardia Kroppenstedtii）国内未见报道，国外罕见报道。现将本院1例克罗彭斯特诺卡菌感染病例的临床资料及鉴定过程报道如下。

1　资料与方法

1.1一般资料

患者男，67岁，农民，既往体健。2016年5月因“右食指进行性红肿伴疼痛”急性起病1周新入院。血常规提示：白细胞总数10.32×109/L，中性粒细胞比例84.3%，血红蛋白141g/L，血小板总数130×109/L。予以局部穿刺抽脓，脓液送细菌培养。查体：T 36.3℃，P 74次/分，R 20次/min，BP 135/83mm Hg，一般状况好，心肺腹无特殊，患者神志清，精神软，专科情况：见右手掌肿胀，以右食指及手掌骨侧缘为甚，局部皮肤红肿，表面无破溃，可见少量黑色药残留物（自敷草药处理，症状未见好转，肿胀呈进行性增大，并向近节及手掌蔓延），有淤血，局部压痛（+），可扪及右食指及手掌挠骨波动感，右食指屈曲受损，指端血运可，皮肤感觉无减退。于右食指中节、近节桡侧缘及手掌膜层，纵向切开腱鞘，见切口流出咖啡色脓液，量约2mL取脓液送微生物室检查。据患者口述：脓肿部位一年前曾被竹锹刺伤后化脓发炎，当时在当地镇医院清创消炎半月痊愈。

1.2检测用仪器、试剂

仪器：普通培养箱WS2-134-65型（上海跃进）；Olympus CX21显微镜（奥林巴斯公司）；3730XL测序仪（ABI公司）等。

试剂：血平板（广州迪景公司）、巧克力平板、麦康凯平板（梅里埃）等；快速革兰染液、抗酸（萋-尼氏）染液（珠海贝索公司）；弱抗酸（改良Kinyoun）染液[2]（将抗酸染液Ⅱ液中的脱色剂盐酸改成1%的盐酸。改良抗酸染色具体步骤：石炭酸复红5min→1%硫酸脱色3min→亚甲蓝复染3～5min）。

1.3分离与鉴定

分离与鉴定参照《临床检验操作规程》第4版中的细菌鉴定方法，取咖啡色脓液接种血平板（SBA）、巧克力平板、和麦康凯（MAC）培养基，35℃培养24、48h……观察菌落。另取脓液直接涂片革兰染色镜检。将血平板（培养48h菌落）上送广州金域检验中心做质谱技术鉴定和靶向DNA测序（16SrRNA基因扩增）鉴定细菌，同时采用微量生化鉴定管对待测菌株进行测定，并延长培养时间5d看结果。

2　结果

2.1临床治疗与结果

此患者入院急诊行“右食指脓肿切开引流手术”，术后经验给药：给予“头孢噻肟钠/舒巴坦钠”抗感染、“七叶皂苷钠”消肿止痛、“血栓通”改善循环等对症治疗效果不好，术口换药时有脓性分泌物渗出，患者右手掌肿胀无好转并前臂稍红肿，夜间疼痛不能安睡，感染控制欠佳，后细菌培养经靶向DNA鉴定为克罗彭斯特诺卡菌，依据《热病》[3]调整抗菌药，口服大剂量磺胺甲基异恶唑，定时清洗引流术口，术口逐步愈合，出院后仍坚持服药，定期随防无复发。

2.2细菌表型特征

送检的咖啡色脓液直接涂片进行革兰染色见大量白细胞及呈90°分枝角革兰氏阳性分枝菌丝（见图1），末端不膨大，遂又加染抗酸及弱抗酸涂片，结果抗酸染色菌体为阴性，弱抗酸染色菌体为阳性：大量白细胞蓝色背景下呈90°分枝角的红色分枝菌丝[4-5]（见图2）。

图1　脓液涂片，克罗彭斯特诺卡菌（革兰染色×1000）

图2　脓液涂片，克罗彭斯特诺卡菌 （改良抗酸染色×1000）

35℃需氧培养48h后，在血平板及巧克力平板上可见较纯细小菌落，白色粗颗粒样，表面干燥，无溶血现象，时间延长则菌落出现淡黄色且起皱褶，表面出现粉状菌丝，堆叠如皮革样（血平板上较平坦少皱褶，见图3；巧克力平板及普通琼脂较多皱褶，见图4），但无嵌入培养基内现象，整个菌落不易乳化，菌落涂片后菌体形态结果与脓液直接涂片图1、图2一致，菌落有轻微泥土气息。在麦康凯培养基不长，在液体培养基生长形成白色菌膜，浮于液面，不易乳化，液体澄清。

图3　克罗彭斯特诺卡菌 SBA6d

图4　克罗彭斯特诺卡菌 巧克力平板6d

2.3普通生化反应

酶（+）、葡萄糖（+）、七叶苷（+）、甘露醇（-）、肌醇（-）、明胶（-）、尿素酶（+）。

该菌的这些种种形态学特征、菌落生化特性，高度怀疑为诺卡菌。

2.4质谱分析

对该分离疑为诺卡菌的菌株本实验室无相应的配套板条鉴定，做质谱，质谱鉴定不出，原因可能是因为质谱库里边缺少这些少见菌菌株信息，有待完善。

2.516S rRNA扩增后测序

由于本微生物室条件有限，对实验室分离疑为诺卡菌的菌株，上送广州金域检验做靶向DNA测序鉴定细菌，通过16S rRNA基因扩增后，在约1500pb处可见单一清晰目的条带，再用ABI公司的3730XL测序仪检测，产物序列片段结果经NCBI（National Center of Biotechnology Information ，美国国家生物技术信息中心）的BLAST进行同源性比对，与克罗彭斯特诺卡菌（GenBank No.DQ157924.2）的同源性达100%，说明扩增片段为目的基因。

3　讨论

诺卡菌存在于土壤等自然环境中，为腐生性，为临床不常见病原菌。主要由呼吸道、手术、外伤病原菌侵入机体，引起化脓性感染或肉芽肿性疾病，好发于肺部、足[6]和腿部（局限型），尤其对免疫力低下者易形成感染，感染后可播散到全身及中枢神经系统（播散型）。一般局限者预后佳，播散型者预后差，死亡率高，有报道诺卡菌颅内感染死亡率为100%，肺部感染为41%，播散性感染为64%[7]。Nocard于1888年首次鉴定出诺卡菌，国内自1964年以来陆续有报道，近年来诺卡菌病呈上升趋势。我国诺卡菌病患者的老年人数量较多[8]，随着逐渐进入老年化社会，发病率也越来越高，这与老年人免疫功能低下相关。本病例也是一位老年人，原始病灶是手，国内外罕见报道，经靶向DNA测序鉴定的克罗彭斯特诺卡菌，国内外也鲜见报道，因为此菌株是2014年新入库NCBI的诺卡菌种，分离自肺移植患者肺部感染标本[9]。

诺卡菌隶属于细菌域、放线菌纲、放线菌亚纲、放线菌目、棒杆菌亚目、诺卡菌科（Nocardiaceae），目前属内有89种[7]。诺卡菌属革兰染色阳性或不定，不形成芽孢、无鞭毛。改良抗酸染色为弱阳性，原始标本直接涂片常可见具有诊断意义的呈90°分枝角的菌丝。培养为严格需氧菌，营养要求不高，在普通琼脂培养基、沙保罗琼脂即可缓慢繁殖生长，初代分离常需孵育一周，在室温或35℃普通培养基上培养24～48h才能看到针尖大小的菌落，并常会被一些其他普通大菌落覆盖，在常规检验中很容易被遗漏，需要与原始标本涂片（特别是痰涂片）及临床（怀疑诺卡菌）相结合，所以接收到标本时建议在常规接种的同时涂片，在显微镜下见到G+杆菌呈分枝状或革兰氏染色着色不均匀的丝状菌时，需要高度怀疑并延长标本培养时间观察，否则容易造成漏诊。培养三到四天该菌属菌落表面干燥白色，或淡黄色，且该菌属在不同培养基或不同时间菌落形态差异很大[4]（见图3 ～ 4），不溶于生理盐水（不易乳化），还可见淡黄色粗颗粒边缘嵌入培养基中（俗称咬琼脂），但本病例中的克罗彭斯特诺卡菌例外（没咬琼脂现象）。

另外，诺卡菌在生长和形态上的特点与非结核分枝杆菌（nontuberculosis mycobacteria，NTM）及链霉菌很相似，临床上肺部诺卡菌病与肺部结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）病症状相似，容易引起误诊[10]，主要区别在于结核分支杆菌普通抗酸染色法抗酸性强，盐酸乙醇不易脱色，诺卡菌抗酸染色弱阳性，易被盐酸乙醇脱色[11]，用弱抗酸染色法可以区分诺卡菌属与分枝杆菌属。诺卡菌与链霉菌的区别见表1。

表1　诺卡菌与链霉菌匠鉴别要点

诺卡菌因为其生化反应不典型，临床少见，生长缓慢，导致传统的分类、鉴定方法（形态学、生化反应）可靠性不强，而且鉴定此菌种耗时费力、低效，难以满足临床需求。近几年新兴的质谱分析法暂还只能覆盖常见菌种，而少见菌种等信息不够齐全，仍有待完善，因此，最受瞩目的仍然是遗传学——分子生物学的诊断方法[12]，如靶向DNA测序（16S rRNA基因扩增）鉴定。细菌16S rRNA的相对分子量大小适中，约1500bp，适合序列分析，又因其含有对所有细菌种及可变区的广泛区段[13]，因此16S rRNA基因成为细菌系统分类鉴定的理想靶序列，也广泛被细菌学家和分类学家接受和使用[14]。所以在DNA序列分析中，16S rRNA最常用于鉴定细菌的种，可以快速、简便、特异性好，准确地诊断诺卡菌到种，也是目前对克罗彭斯特菌诺卡菌这些临床少见菌的鉴定、检测和新菌种发现方面最可靠的方法之一[1]。

本例患者为手局部感染，临床医生根据《热病》[3]建议，首选采用复方新诺明（TMP-SMX）治疗、清创处理皮肤坏死组织，随后患者病情好转，局部感染症状减轻，巩固治疗后出院，定期随防无复发。《热病》[3]对于诺卡菌的治疗首选药物为磺胺类药物，但磺胺类药物会引起不良反应包括胃肠道症状、皮肤症状、肾功能损害、肝毒性和骨髓抑制。尤其在艾滋病患者不良反应的发生率更高。所以对于磺胺类药物过敏、发生严重不良反应、对磺胺类药物耐受或治疗失败时的患者应更换其他敏感抗生素，如亚胺培南、利奈唑胺、阿米卡星、第三代头孢菌素等进行治疗。

综上所述，实验室可根据细菌形态学特征、菌落生化特性[15]结合遗传学分析（16S rRNA基因扩增后做靶向DNA测序）鉴定诺卡菌属，可及时、准确鉴定出克罗彭斯特诺卡菌这类生长缓慢、罕见细菌，对诺卡菌病的确诊、治疗、预后有着重大意义。

[1]周庭银，倪语星，王明贵，等.血流感染实验诊断与临床诊治 [M].第2版.上海：上海科学技术出版社，2014：81-82，170.

[2]陈东科，孙长贵.实用临床微生物学检验与图谱[M].北京：人民卫生出版社，2010：78.

[3]Jay P，Sanford.桑福德抗微生物治疗指南（热病）[M].第44版.北京：中国协和医科大学出版社，2016：69.

[4]陈东科、孙长贵.临床微生物学鉴定图谱[M].北京：人民卫生出版社，2016：223-228.

[5]张秀珍，朱德妹.临床微生物检验问与答 [M].第2版.北京：人民卫生出版社，2014：114-115

[6]沈定霞.临床感染性疾病-病原学诊断与分析[M].北京：人民军医出版社，2009：140-144.

[7]Martinez Tomas R，Menendez Villanueva R，Reyes Czlzada S，et al.Pulmonary nocardiosis：risk factors and outcomes[J].Respirology，2007，12（3）：394-400.

[8]黄慧，陆志伟，徐作军.诺卡菌感染26 例临床特点分析[J].中华结核和呼吸杂志，2010，33（9）：651-655.

[9]Amanda L，Jones，Andrew J.Fisher，4Rahul Mahida，Nocardia kroppenstedtii sp.nov，an actinomycete isolated from a lung transplant patient with a pulmonary infection[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2014，64（25）： 751-754.

[10]李晓亮，张媛媛，赵平，等.一株马鼻疽诺卡菌临床分离株的鉴定[J].中国人兽共患病学报，2011，27（5）：411-413，417.

[11]尚红，王毓三，申子瑜.全国临床检验操作规程 [M].第4版.北京：人民卫生出版社，656：679-681.

[12]顾云峰、陈蕾、上官宗校，等.一株罕见盖尔森基兴诺卡菌的鉴定[J].中华微生物学和免疫学杂志，2015，35（12）：874.

[13]沈定树，周雪艳.诺卡菌属的分类与实验室检查[J].临床检验杂志，2010，28（1）：57-58.

[14]李路茜，张媛媛，刘海灿，等.16S rRNA序列在诺卡菌菌种鉴定中的价值研究[J].中国人兽共患病学报，2015，31（11）：1017-1022.

[15]周庭银，倪语星，胡继红，等.临床微生物检验与标准化操作 [M].第3版.上海：上海科学技术出版社，2015：408-409.

The identification on an uncommon infection of Nocardia Kroppenstedtii in hand

ZHOU Shijuan
Huidong County People's Hospital,Huidong 516300,China

Objective To explore the method to identify the rare Nocardia Kroppenstedtii. Methods After isolating a strain from a patient’s hand, the method of combining bacterial morphology, colony biochemical characteristics analysis, genetic analysis (such as mass spectrometry, sequencing targeting DNA after 16S rRNA gene amplification) etc. were used for the identification. Results Observed through microscope,the rare bacteria by the clinical isolates had typical cell feature (the result of Gram stain shows 90° branching angle and G+branching hyphae and improved Kinyoun staining shows positive result),slow growth in blood agar and chocolate plate, small colonies, extended time to fold, catalase positive, breakdown of glucose, Esculin, urease, not broken down mannitol, inositol, gelatin. Then a comprehensive analysis included targeting DNA sequencing after 16S rRNA gene amplification was analyzed, and it was finally identified as Nocardia Kroppenstedtii. Conclusion Morphology observation, colony sublimation characteristic analysis and genetic analysis (such as sequencing targeting DNA after 16S rRNA gene amplification) any laboratory can identify Nocardia and can quickly, accurately identify Nocardia Kroppenstedtii, which is a type of rare strain with slow growth.

16S rRNA;Sequencing;Nocardia Kroppenstedtii

R446.5

B

2095-0616（2016）18-221-04

广东省惠州市科技计划项目（20160806）。

（2016-07-14）