人类癌症特异敏感标志物：循环肿瘤DNA

吴龙 王穗海 梁志坤★

·综述·

人类癌症特异敏感标志物：循环肿瘤DNA

吴龙1王穗海2梁志坤1★

循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）是由肿瘤细胞释放到血液循环系统中的DNA，它可作为多种癌症的生物学标志物。ctDNA的检测具有操作简便快速、无创、特异性和高敏感性等特征，以下一代测序（next⁃generation sequencing，NGS）技术为基础的ctDNA分析方法可通过突变状态反映肿瘤基因组信息，在肿瘤的研究领域和临床应用发挥重要的作用，可决策一个全新的癌症治疗方案。ctDNA作为新兴的“液体活检”靶标，其具有广阔的应用前景和推进精准医疗的实施。本文概括了ctDNA在多种癌症（乳腺癌、肺癌和结直肠癌）中的高频率突变基因、ctDNA的最新检测技术和ctDNA在临床诊断、疗效监控及预后判断中的良好效果，以推动NGS技术为基础的ctDNA检测方法在临床医学中的应用。

ctDNA；下一代测序；肿瘤；液体活检

组织活检作为癌症诊断、分期和治疗决策的主体，其角色已从简单的组织学检查演变为复杂的遗传分析。尽管它很有效用，但仅仅代表一个位置单个时间点的状态，往往不足以描述整个恶性肿瘤的情况及其演变过程，因为附近组织可能包含更多的遗传信息会影响到分期和治疗。而且侵入性和活检固有的选择偏好性也限制了其作为实时监控工具的有用性。为了克服这一缺点，人们开始寻找各种肿瘤生物标志物，如蛋白质标记物，循环肿瘤细胞和循环肿瘤DNA（circulating tu⁃

mor DNA，ctDNA）等。近几年，研究表明肿瘤患者ctDNA所携带的肿瘤突变信息与肿瘤组织具有良好的一致性［1⁃3］，因此肿瘤循环DNA引起了人们的极大关注。Newman等［4］发明的高敏感度ctDNA定量检测技术：肿瘤个性化深度测序分析方法（cancer personalized profiling by deep sequencing，CAPP⁃Seq），使得ctDNA的检测有了突出的进步，从而使检测血液样品中低浓度ctDNA成为可能，进而能够跟踪肿瘤的发展状态。本文就ctDNA在多种肿瘤诊疗中应用的情况及在肿瘤的诊断、疗效监测及预后判断等方面的潜在作用进行介绍，以推动下一代测序（nextgeneration sequencing，NGS）技术为基础的ctDNA检测方法在临床医学中的应用。

1 ctDNA的特性

循环肿瘤DNA（ctDNA）指的是由肿瘤细胞释放到血液循环系统中的DNA。而细胞游离DNA（cell free DNA，cfDNA），或者叫血浆游离DNA，是指血浆中游离存在的DNA，它们有的来自于正常细胞，有的来自于异常细胞（如肿瘤细胞），还有部分来自于人体外部（如病毒DNA）。正常cfDNA与ctDNA的区别在于是否存在突变。体细胞突变，只在癌细胞或癌前细胞的基因组中，通常是单碱基对取代，却不会存在于同一个体的正常细胞的DNA中，这样才能保证ctDNA作为特异性的生物标记物。

2 肿瘤患者中的ctDNA

在20世纪40年代后期第一次在人体循环中发现游离的DNA，随后在20世纪70年代分离出了肿瘤特异性遗传物质。然而，ctDNA检测的发展相当缓慢，甚至落后于产前诊断。ctDNA面临的挑战包括充满变异，且血液中的ctDNA浓度较低，特别是在早期肿瘤，这阻碍了它的快速发展和更好地融入临床实践。幸运的是，靶向选择和扩增方法技术以及测序方法的进步促进了这些微量ctDNA的检测。一种被称为磁珠乳液扩增（beads emulsion amplification and magnetics，BEAM ing）的方法［5］，它能够靶向选择以增强靶区域的捕获效率，使捕获的灵敏度高达0.01％［6］。这样精准的检测能力使研究人员能够探索ctDNA的临床适用性，对癌症进行实时监控。

2.1 乳腺癌患者中ctDNA

转移性乳腺癌需要对肿瘤的负荷进行监控，以确定对治疗的反应，并且选择适宜的生物标志物。Dawson等［3］通过对PIK3CA和TP53的点突变进行检测，发现30位女性中有29位（97％）的体细胞基因组发生突变，成功地检测到ctDNA，其表达水平波动较大，并且波动与肿瘤负荷呈现出显著的相关性。与此同时，ctDNA比癌抗原15⁃3（CA15⁃3）和循环肿瘤细胞的检测具有更高的灵敏度。Heidary对转移乳腺癌相关基因（PCDH20，OR4X1，ALK，DNPEP，SH3TC2，DDR2，MLL3，PIK3CA）的检测，同样发现ctDNA水平表现出较大范围的波动［7］。现在，40％乳腺癌患者存在PIK3CA（I类磷脂酰肌醇⁃3⁃激酶（PI3K）催化亚基）的体细胞突变，而PIK3CA则是调节PI3K信号转导所必须。通过对COSM IC数据库的检索同样可以发现乳腺癌患者中的PIK3CA和TP53这2个基因是高频率突变基因［8］。毫无疑问，在乳腺癌诊断中，ctDNA将有望成为替代癌抗原15⁃3（CA15⁃3）和循环肿瘤细胞成为新的肿瘤生物标志物，而对PIK3CA和TP53进行检测则可以很好反应乳腺癌状态。

2.2 肺癌患者中ctDNA

Maheswaran等［9］在肺癌细胞中检测到EGFR和KRAS基因的突变，揭开了肺癌靶向治疗的可能路径。Yung等［10］使用数字聚合酶链反应（digital polymerase chain reaction，dPCR）技术在非小细胞肺癌（non⁃small⁃cell lung cancer，NSCLC）患者的血浆ctDNA中检测到表皮生长因子受体（epidermal grow th factor receptor，EGFR）突变，其外显子19缺失和L858R突变频率分别为17％和26％，与肿瘤样本的测序结果相比较，肿瘤样本中EGFR突变的敏感性和特异性分别为92％和100％，同时，突变序列的数量和临床应答呈相关关系。Punnoose等［11］也观察到在血浆中ctDNA中EGFR突变的状态与相应的肿瘤组织大小是一致的，这意味着可以使用ctDNA实时评估突变状态。Wang等［12］发现在非小细胞肺癌患者血浆ctDNA中，KRAS突变和相应肿瘤组织也呈相关关系，在血浆和肿瘤中KRAS突变的一致性为76.7％。美国大约10％非小细胞肺癌患者、东亚35％的非小细胞肺癌患者和EGFR有关［13⁃14］。非小细胞肺癌患者中，EGFR、KRAS和ALK几乎是单独起作用的，只要一个突变

代替另一个突变都会影响靶向治疗反应。因此，对ctDNA的突变量进行监测可以很好评估肿瘤状态，反应肿瘤是否发生及发生后的变化情况。

2.3 结直肠癌患者中ctDNA

长期对结直肠癌遗传改变的观察发现，在大肠癌患者血清或血浆中都可以检测到癌基因KRAS、抑癌基因TP53和APC的基因突变［15］。大肠癌患者细胞游离循环DNA中第一个鉴别的遗传改变是癌基因KRAS的突变。大多数出版的文章都致力于此标记的研究，主要有以下几个原因：有原癌基因KRAS突变在大肠癌发病率较高（约50％）［16-17］；结直肠癌发生的过程中，甚至是在腺瘤阶段，原癌基因KRAS突变是最早的遗传改变［18］；大约80％的大肠癌患者癌基因表现出KRAS突变的范围很小，通常在密码子12，偶尔在密码子13，少数在第61位密码子［19-20］。通过等位基因特异性引物定量聚合酶链反应技术，对KRAS第2外显子7个点突变（G12V，G12A，G12D，G12S，G12C，G12R和G13D）和BRAF第15外显子点突变（V600E）进行分析，结果显示在KRAS的7个第二外显子突变和BRAF V600E突变的检出率分别为92％和100％［21］。对COSM IC数据库检索可以发现，这7个最频繁的KRAS突变占KRAS总突变的90％，BRAF V600E突变占所有BRAF突变的98％。ctDNA中KRAS基因发生突变位点的一致性，更有利于其作为肿瘤的生物标志物。

3 ctDNA检测技术

ctDNA在血液循环中浓度很低且以碎片化呈现，这是ctDNA检测的主要挑战。目前，检测和分析ctDNA的方法很多，这在杨超等［22］的文章中有较为详细的介绍。之前大多数方法的灵敏度都偏低，随着ctDNA的发展和技术的进步，最近出现几种高灵敏度的检测方法。标记扩增深度测序（tagged⁃amplicon deep sequencing，TAM⁃Seq）、数字聚合酶链反应技术（digital PCR）、BEAM ing、焦磷酸活化的聚合反应（pyrophosphorolysis⁃activated polymerization，PAP）和CAPP⁃Seq等的出现极大提高了检测ctDNA的敏感性。使用数字聚合酶链反应技术对晚期胃癌、胰腺癌、卵巢癌、结直肠癌和乳腺癌等的ctDNA检出率可达75％以上［23］。使用CAPP⁃Seq方法对非小细胞肺癌设计可检测多类型外显子改变，大于95％肿瘤中可以检测到突变［4］。对于ctDNA在Ⅱ⁃Ⅳ期的NSCLC患者，敏感性达到100％，Ⅰ期NSCLC患者的敏感性达到50％，该方法检测EGFR和KRAS中频率高于0.1％的突变时，检出率为100％，特异性为99％。由此可见，CAPP⁃Seq可用于局部晚期或转移性NSCLC患者的非侵入性肿瘤基因分型。ctDNA的水平与肿瘤体积显著相关，Ⅱ、Ⅲ期患者在放射治疗过程中肿瘤会出现炎症或纤维化，导致影像学检查无法正确判断肿瘤是否存在，而对ctDNA的检测结果可以判断肿瘤的状态。因此，ctDNA水平与临床预后之间的相关性似乎优于影像学检查，并提供了快速的反应评估。我们设想，对ctD⁃NA的检测可以常规应用于临床检测和监测多样恶性肿瘤，从而便于个体化的癌症疗法。

4 ctDNA的临床应用

随着二代基因测序技术的发展，ctDNA检测技术可以快速和高效地检测到肿瘤中的基因突变，逐渐成为“液体活检”的主要手段，其临床运用包括以下3个方面。

4.1 癌症早期诊断与癌症分期

近年来，在影像学检查结果不明确的情况下，循环生物标志物在评估疾病严重程度方面起到重要作用，如CA19⁃9、CA⁃125、甲胎蛋白（alphafeto⁃protein，AFP）和前列腺特异性抗原（prostatic spe⁃cific antigen，PSA）。然而很多的恶性肿瘤并不具有可靠的蛋白质标记物，即使在有生物标志物的疾病中，也有可能因为缺乏特异性而无法使用。此外，多数的蛋白质生物标志物在血液循环中持续时间较长，可达数周，要准确评估则需要等到数周或数月后。而ctDNA的半衰期短（约2 h），可动态评估癌症情况。另外，ctDNA的检测准确性高，且ctDNA水平与肿瘤的大小之间相关程度高，根据ctDNA的突变量的进行监测可以很好评估肿瘤状态，进行早期诊断和肿瘤分期。

4.2 肿瘤的疗效评估

ctDNA可作为安全可靠的疗效评估指标。肿瘤患者在临床治疗过程中通常会产生药物抗性，使得原本有效的药物失去治疗作用，其主要原因可能是基因组成或蛋白调控通路发生改变。例如，原发性结直肠癌患者血浆中的NRAS和KRAS DNA片段原本不存在16号密码子突变，使用EG⁃FR阻滞剂治疗后，两者突变频率显著升高，患者

可检出率约46％［23］。研究发现，大约一半肺癌患者对厄洛替尼和吉非替尼不敏感，主要原因是血浆中EGFR的DNA中发生T790M突变［24］。在结直肠癌中对阻断EGFR的单克隆抗体西妥昔单抗和帕尼单抗的二次抵抗则与KRAS突变或MET基因扩增有关［25⁃26］。因此，检测ctDNA进行基因分析可动态监测药物的靶向位点是否发生改变，筛选出最佳治疗方案，快速有效地在临床耐药前采取替代药物达到精准施药的效果，避免无效治疗并减少药物产生的副作用。

4.3 复发监测和预后判断

肿瘤切除后，没有检测到ctDNA与没有肿瘤复发相关联。此外，各种类型的晚期癌症都能检测到ctDNA的存在。2007年，BEAM ing扩增法的开发者美国约翰霍普金斯大学Vogelstein和Kinzler对18名肠癌患者的ctDNA进行了跟踪。研究显示，术后仍能检测到ctDNA的患者，基本上都出现了复发，而术后未检测到ctDNA的患者，肠癌无复发［27］。该项研究结果表明，ctDNA能展现患者对手术的应答情况。研究者在其他癌症中得到了类似结果，包括卵巢癌、乳腺癌以及来自其他器官的肿瘤，比如胰脏、膀胱、皮肤、胃、食道、肝脏和头颈。

与循环肿瘤细胞计数相比，ctDNA在肿瘤特异性突变的预后判断方面显示出明显的优越性［28］。在晚期非小细胞肺癌患者的研究结果表明，在基因突变检测方面ctDNA显示出较高的灵敏度，同时在与之相匹配肿瘤的突变状态检测方面，ctDNA也显示出较高的一致性［29］。ctDNA适用于手术后的6～8周进行检测，以获得最佳的决策方案［30］。因此，对血浆ctDNA进行检测可以作为癌症患者的预后生物标志物，用来分析患者的复发风险。

5 小结

与传统的组织活检或固相活检相比较，液态活检呈现出巨大的优势。而在液体活检中，ctDNA、比其他的肿瘤标记物具有准确性高、半衰期短等优势。虽然ctDNA与其他标志物相比优势明显，但是ctDNA的研究仍处于前期阶段，也具有一定的局限性。其一，ctDNA的样本收集、处理等环节没有标准化流程，各实验室之间存在差异；其二，使用ctDNA进行肿瘤分期、临床转移和复发预测时，暂时尚无标准的ctDNA标志物及含量的阈值，或矫正曲线；其三，使用NGS进行ctDNA检测成本较高，进一步改进检测方法以降低成本显得尤为重要。

综上所述，ctDNA检测技术是一种操作简便快速、无创、高敏感性和特异性的“液相活检”技术，使用该技术对ctDNA进行检测能够突破肿瘤异质性的限制，可反映肿瘤基因组信息，且有利于掌握血液循环中的特异性突变，进行肿瘤的诊断、疗效监测及预后判断等。因而ctDNA将会越来越多的用于肿瘤的预防以及个体化治疗的开展，从而推进精准医疗的实施。

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ctDNA:a specific and sensitive biomarker for human cancers

WU Long1,WANG Suihai2,LIANG Zhikun1★
(1.Guangzhou darui Biotechnology Co.,Ltd.,Guangzhou,Guangdong,China,510665;2.Schoolof Laboratory Medicine and Biotechnology,Southern Medical University,Guangzhou,Guangdong,China,510515)

Circulating tumor DNA(ctDNA)is a kind of circulating DNA fragments carrying tumor specific sequence alterations and are found in blood.It can be used as a variety of cancer biomarkers.ctDNA can be detected simply,rapidly,non⁃invasively,w ith high specificity and sensitivity.The analysis method based on next⁃generation sequencing(NGS)technologies detecting ctDNA can reflect tumor genom ic informa⁃tion bymutation status,and plays an important role in research and clinical application of cancer treatment,and treatment decision⁃making.As a new"liquid biopsy"target,ctDNA has broad application prospects and w ill fa⁃cilitate the implementation of precise care.This article outlines high frequencymutations in the gene of ctDNA in cancers(breast cancer,lung cancer and colorectal cancer),the latest detection technologies of ctDNA,the good effect of tumor diagnosis,prognosis and efficacy monitoring by detecting ctDNA.It can promote the ap⁃plication of NGS technologiesby detecting ctDNA in clinicalmedicine.

ctDNA;Next⁃generation sequencing;Tumor;Liquid biopsy

广东省科技计划应用型科技研发专项（2015B020233009）

1.广州市达瑞生物技术股份有限公司，广东，广州510665 2.南方医科大学检验与生物技术学院，广东，广州510515

★通讯作者：梁志坤，E⁃mail:zhikun_liang@126.com