应用下一代测序技术对α地中海贫血进行胚胎植入前遗传学检测

谢美娟 邓权衡 邓红辉 卢绍月 杨学习 马强★

·论著·

应用下一代测序技术对α地中海贫血进行胚胎植入前遗传学检测

谢美娟1邓权衡1邓红辉1卢绍月1杨学习2马强2★

目的探讨下一代测序（nextgeneration sequencing，NGS）技术在α地中海贫血胚胎植入前遗传学检测中的应用。方法选取2对α地中海贫血⁃⁃SEA缺失型携带者夫妇体外受精胚胎活检后的6个胚胎样本应用全基因组扩增（whole genome amplification，WGA）技术、下一代测序技术进行胚胎植入前遗传学检测，同时采用跨越断裂点荧光PCR（gap⁃PCR）进行平行对照检测。结果2个家系6个胚胎样本的胚胎植入前遗传学诊断（preimplantation genetic diagnosis，PGD）结果分别为⁃⁃SEA/ αα母源携带、⁃⁃SEA/⁃⁃SEA、⁃⁃SEA/αα母源携带、⁃⁃SEA/⁃⁃SEA、⁃⁃SEA/αα母源携带和⁃⁃SEA/⁃⁃SEA；胚胎植入前遗传学筛查（preimplantation genetic screening，PGS）结果分别为45，XX，⁃5、46，XX、46，XY、47，XY，+1、46，XX和46，XY，+1，⁃2；Family 1 gap⁃PCR检测结果为父母均为SEA杂合子；E1为正常、E2为SEA纯合子、E3为正常；Family 2检测结果分别为：父母均为SEA杂合子；E4为SEA纯合子、E5为正常、E6为SEA纯合子。结论结果显示利用NGS不仅可以检测出23对染色体的核型，同时解决了单细胞扩增等位基因脱扣（allele drop⁃out，ADO）造成的假阳性和假阴性的风险，更具有市场潜力及应用前景。

下一代测序；α地中海贫血；胚胎植入前遗传学诊断；跨越断裂点荧光PCR

α⁃地中海贫血，是一组因α⁃珠蛋白链合成减少或不能合成、α⁃链/非α⁃链比例失衡为特征的遗传溶血性血红蛋白病。我国南方为α⁃地中海贫血的高发区，其携带率也高达8.53％［1］；其中以东南亚（⁃⁃SEA）缺失型最为常见，其发生率为72.87％～82.87％［2］。α⁃地中海贫血与出生缺陷有密切关系，也给社会和家庭带来了沉重的负担，而目前，α⁃地中海贫血还没有有效的根治方法，主要以预防为主。因此，采用植入前期胚胎筛查来阻断患儿的出生极为重要。

胚胎植入前遗传学检测主要包括胚胎植入前遗传学诊断（preimplantation genetic diagnosis，PGD）和胚胎植入前遗传学筛查（preimplantation genetic screening，PGS）2方面。PGD是在胚胎着床之前即对配子或胚胎进行遗传物质分析，选择没有遗传物质异常的胚胎移植，可以有效地阻断患儿的出生；PGS是选择染色体整倍体的胚胎进行移植，进而提高体外受精⁃胚胎移植（in vitro fer⁃tilization⁃embryo transfer，IVF⁃ET）技术的成功率。

随着我国全面二孩政策的放开，高龄产妇数量猛增，再加上不孕不育率逐年上升，提高妊娠率和妊娠质量已经成为亟待解决的问题。目前，以PGD/PGS为代表的第三代试管婴儿正是解决这些问题的关键技术［3⁃4］。此外，NGS具有高通量、自动化、低成本的特征，自2008年以来，全基因组测序费用呈指数级下降，使得NGS在PGD/PGS临床上的应用得到迅速推广。本研究采用NGS对α⁃地中海贫血进行胚胎植入前遗传学检测，探讨NGS应用于PGD/PGS临床检测的可行性。

1 材料与方法

1.1 主要仪器和试剂

QIAamp®DNA M iniand QIAamp DNA Blood M ini Kits、The REPLI⁃g Single Cell Kit购自德国Qiagen公司；Ion AmpliseqTMlibrary kit 2.0、Ion PGM™Template OT2 200 Kit、Ion PGM™Sequenc⁃ing 200 Kit v2、Ion Personal Genome Machine®（PGM™）、Qubit®2.0均购自美国Life Technology公司；α⁃地中海贫血基因检测试剂盒（gap⁃PCR法）购自中山大学达安基因股份有限公司；Nuclease⁃FreeWater购自美国Life Technologies公司；无水乙醇（分析纯）购自广州化学试剂厂。

1.2 研究对象

2个家系双方均为α⁃地中海贫血⁃⁃SEA缺失型杂合子夫妇经体外受精胚胎活检后共6个胚胎囊胚期滋养外胚层细胞以及夫妻双方外周血。

1.3 实验方法

1.3.1 全基因组扩增、基因组DNA提取

使用The REPLI⁃g Single Cell Kit对6个胚胎囊胚期滋养外胚层细胞进行全基因组扩增；采用QIAamp®DNA M ini and QIAamp DNA Blood M ini Kits对2对夫妇的全血样本进行基因组DNA提取；具体操作步骤参见说明书。

1.3.2 下一代测序

根据测序需要，使用Ion AmpliseqTMlibrary kit 2.0将扩增好的DNA构建成文库DNA。PCR特异性扩增目的片段，在DNA片段两端加上通用测序接头，PCR扩增文库DNA，磁珠纯化去除杂质；建库后使用Qubit®2.0测定文库DNA的浓度；根据每个样本测序数据需求量和测序深度确定文库的混样个数为10个进行模板制备，使用Ion PGM™Template OT2 200 Kit制备测序模板；然后进行阳性模板的富集即去除杂质及扩增失败的测序模板；最后使用Ion PGM™Sequencing 200 Kit v2在PGM™上进行测序。

1.3.3 下一代测序数据分析

将上机测序得到的原始数据利用Tor⁃rent_Server_5.0_VM软件去除接头序列，通过Tor⁃rent Mapping A lignment Program（TMAP）软件比对到人类基因组参考序列hg19上，通过sam tools统计覆盖倍数，通过GATK calling SNP基因型分析，最后结合家系的SNP连锁分析，构建单体型。

1.3.4 gap⁃PCR

将2对夫妻双方外周血提取的基因组DNA以及6个胚胎全基因组扩增后的基因组DNA采用α⁃地中海贫血基因检测试剂盒进行gap⁃PCR检测，实验操作、结果判读参见说明书。

2 结果

表1 6个胚胎下一代测序结果汇总表Table 1 Results of 6 embryos detected by NGS

表2 Fam ily 1 PGD结果Table 2 PGD results of fam ily 1

2.1 下一代测序结果

本次研究收集2对地中海贫血携带者夫妇体外受精胚胎活检的6个囊胚期滋养外胚层细胞以及2对夫妻双方外周血基因组样本进行下一代测序。下一代测序检测结果汇总表见表1。

将夫妻双方外周血测序数据及其各自的胚胎测序数据进行家系的SNP连锁分析，构建单体型，进行结果的判断，6例胚胎样本中，PGD结果分别为E1：⁃⁃SEA/αα母源携带；E2：⁃⁃SEA/⁃⁃SEA；E3：⁃⁃SEA/αα母源携带；E4：⁃⁃SEA/⁃⁃SEA；E5：⁃⁃SEA/αα母源携带；E6：⁃⁃SEA/⁃⁃SEA，详见表2、表3。

表3 Fam ily 2 PGD结果Table 3 PGD resultsof family 2

表4 2种检测方法结果比对Table 4 The comparison results of PGD and gap⁃PCR

为提高IVF⁃ET的成功率，再将6个胚胎进行PGS检测，PGS检测结果分别为E1：45，XX，⁃5；E2：46，XX；E3：46，XY；E4：47，XY，+1；E5：46，XX；E6：46，XY，+1，⁃2。详见图1、图2。

2.2 gap⁃PCR检测结果

为了验证本次检测结果的准确性，将2个家系样本同时进行gap⁃PCR的检测，Fam ily 1检测结果分别为：父母均为SEA杂合子；E1为正常、E2为 SEA纯合子、E3为正常；凝胶电泳图结果见图3；Fam ily 2检测结果分别为：父母均为SEA杂合子；E4为SEA纯合子、E5为正常、E6为SEA纯合子；凝胶电泳图结果见图4。

2.3 2种检测方法结果比对

将2种检测方法的检测结果进行对比，详见表4。结果显示对于SEA纯合缺失样本2种方法检测结果一致，而经过WGA的PCR产物对SEA携带者则检测结果为正常。

3 讨论

目前α⁃地中海贫血SEA缺失型的检测，文献报道的PCR技术已比较成熟［5⁃6］。但PCR技术在PGD中仍然面临着一些问题，如扩增偏倚和ADO等。ADO即一个细胞内来自双亲的2个等位基因只有一个扩增到可供检测的水平的现象，是影响PGD准确性的主要因素之一。ADO的发生率为5％～20％［7⁃8］。其危害在于可导致杂合子胚胎的误诊，是PCR技术进行显性遗传病PGD可靠诊断的最大障碍。

本次实验中共检测2个家系4个外周血样本及6例胚胎样本。PGD结果分别为E1：⁃⁃SEA/αα母源携带；E2：⁃⁃SEA/⁃⁃SEA；E3：⁃⁃SEA/αα母源携带；E4：⁃⁃SEA/⁃⁃SEA；E5：⁃⁃SEA/αα母源携带；E6：⁃⁃SEA/⁃⁃SEA；此外，在辅助生殖领域，染色体非整倍体也被认为是胚胎植入反复失败的重要原因之一［9⁃10］。据文献报道，约50％经IVF的胚胎存在染色体异常，约70％的IVF失败由染色体异常导致［11⁃12］，因此为提高IVF⁃ET的成功率，将6个胚胎进行PGS检测，PGS检测结果分别为E1：45，XX，⁃5；E2：46，XX；E3：46，XY；E4：47，XY，+1；E5：46，XX；E6：46，XY，+1，⁃2；最后为了验证本次检测结果的准确性，将2个家系样本同时进行gap⁃PCR的检测。对比两者结果发现，对于SEA纯合缺失样本2种方法检测结果一致，而经过WGA的PCR产物对SEA携带者则检测结果为正常，与PGD检测结果不一致；这可能是由于在PCR过程中ADO所导致的［13］，而本研究采用WGA结合NGS，通过单体型的构建可以推断出该胚胎2条DNA链的来源从而最终确定其是否携带致病基因；同时，通过低通量的全基因组测序来进行染色体核型的判断，从而选择核型正常且没有致病基因的胚胎进行植入，进而提高体外受精的妊娠率、阻断了地中海贫血患儿的出生。本研究结合WGA与NGS技术解决了样本微量的问题以及ADO造成的假阳性和假阴性的风险；而且还可以准确判断染色体非整倍体，更是解决了一些特殊基因不能直接诊断的局限性、样本污染等问题。

NGS当前已经广泛应用于无创产前诊断，同时也在PGD/PGS领域中应用。国内外均可见到NGS应用于PGD/PGS的报道。早期有报道称PGS不能显著提高植入率和活产率，这可能与早期的PGS技术主要是针对部分染色体异常进行检测有关。Kung等［14］采用活检的滋养外胚层细胞、卵裂球及已知的细胞系比较了NGS和微阵列比较基因组杂交（array⁃comparative genom ic hybridiza⁃tion，aCGH），结果显示，NGS的敏感度和特异度均为100％。而早期PGD主要应用荧光原位杂交（fluoresence in situ hybridization，FISH）和PCR等技术，存在一定的局限性，Moutou等［15］报道了PCR⁃PGD的误诊率为0.15％，而FISH⁃PGD误诊率为0.06％。目前尚未见NGS进行PGD的误诊率的相关报道。PGD/PGS还存在另外一个重要方面的争议是其子代的安全性问题，但目前尚缺乏大样本、前瞻性随机对照研究。无创胚胎染色体筛查（non⁃invasive chromosome screening，NICS）应运而生，该

新技术利用了游离在培养液中极微量的DNA，通过目前单细胞全基因组扩增技术实现对胚胎染色体的全面筛查，把从胚胎上提取细胞的活检形式改革成从培养液中提取DNA的检测形式，保护了胚胎样本的完整性和安全性，但该技术目前尚不成熟，还存在着WGA扩增效率低下、培养液污染等问题，要真正普遍应用于临床还有待进一步的探索。综合各方面因素本研究建立了基于NGS的PGD/ PGS技术，它可以获得基因组的全部信息，通过不同的检测和分析策略，完全有可能实现对植入前胚胎从染色体异常检测，到发现单基因突变甚至是新发突变等各个层面信息，同时该技术也可延伸到其他方面的临床应用，如无创单基因病产前诊断、HLA配型、染色体易位正常和携带者的区分以及亲子鉴定等，更具有市场潜力及应用前景。

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Successful preim p lantation genetic detection for alpha thalassaem ia by using next generation sequencing technology

XIEMeijuan1,DENG Quanheng1,DENG Honghui1,LU Shaoyue1,YANG Xuexi2,MA Qiang2★
(1.Guangzhou DaruiBiotechnology Co.,Ltd.,Guangzhou,Guangdong,China,510665;2.Schoolof Laboratory Medicine and Biotechnology,Southern Medical University,Guangzhou,Guangdong,China,510515)

Objective To explore the application of next generation sequencing(NGS)for alpha⁃thalassem ia in preimplantation genetic detection.Methods 2 couplesw ith alpha⁃thalassem ia Southeast Asia deletion(⁃⁃SEA deletion)and their embryos cells obtained after embryonic biopsy were selected to test by whole genome amplification(WGA)and NGS.Gap⁃PCR was done to all samples as a series of parallel tests. Results The PGD resultswere⁃⁃SEA/αα,⁃⁃SEA/⁃⁃SEA,⁃⁃SEA/αα,⁃⁃SEA/⁃⁃SEA,⁃⁃SEA/ααand⁃⁃SEA/⁃⁃SEA,respectively.And embryosw ith the abnormalαgenewere confirmed from thematernal side according to genealogicalanalysis.The PGS results of 6 embryos from 2 familieswere 45,XX,⁃5;46,XX;46,XY;47,XY, +1;46,XX and 46,XY+1⁃2.Both husbands and w ives of the 2 families gap⁃PCR resultswere heterozygotes w ith⁃⁃SEA deletion.The results of gap⁃PCR were normal in embryos 1,3 and 5 while⁃⁃SEA deletion were

Next generation sequencing;A lpha thalassaem ia;Preimplantation genetic diagnosis; Gap⁃PCR

广州市科技计划项目健康医疗协同创新重大专项（201400000004⁃4）；广州市重大科技攻关项目子课题（2014Y2⁃00220）；广州市科技计划产学研协同创新重大专项（201604020104）；广东省科技计划项目公益研究与能力建设专项（2015A030401040）

1.广州市达瑞生物技术股份有限公司，广东，广州510665 2.南方医科大学检验与生物技术学院，广东，广州510515

★通讯作者：马强，E⁃mail：mqqqm2006@163.com

found in embryos 2,4 and 6 accordingly.Conclusion NGS not only can detect karyotype of 46 chromosomes but also avoid the risk of false positive and false negative caused by the allele drop⁃out(ADO) during the single cellamplification w ith a huge potentialmarketand w ide application prospect.