下一代测序法对新生儿进行苯丙酮尿症致病突变的筛查

王辉芳 叶倩平 杨旭 梁志坤 胡妮娅

·论著·

下一代测序法对新生儿进行苯丙酮尿症致病突变的筛查

王辉芳1叶倩平1杨旭2梁志坤1胡妮娅3★

目的运用基于半导体芯片技术的下一代测序方法对苯丙酮尿症相关基因进行基因测序，筛查出常见的致病突变位，探讨半导体测序技术在遗传病检测方面的应用价值。方法采用AmpliSeq方法通过多重PCR捕获目的片段，然后构建文库，用Ion TorrentPGMTM测序仪进行测序反应，与Sanger一代测序法进行结果比较验证。结果75个临床检测为苯丙酮尿症样本中有57例含致病突变位点，包括有杂合突变、纯合突变以及复合杂合突变。下一代测序结果与Sanger一代测序结果完全一致。结论半导体测序能准确检测苯丙酮尿症常见致病突变，对遗传病发病机制的研究及筛查具有一定的应用价值。

苯丙酮尿症；半导体测序；Ion Torrent PGMTM；基因突变；PAH基因

苯丙酮尿症（phenylketonuria，PKU）是由于肝脏苯丙氨酸羟化酶（phenylalanine hydroxylase，PAH）缺乏所致的一种严重的遗传性氨基酸代谢障碍性疾病，为常染色体隐性遗传病［1⁃2］。苯丙酮尿症患儿出生后若不及时治疗，会出现智力低下、体格发育迟缓等症状［2⁃3］。苯丙酮尿症是少数可治疗的遗传病之一，尽早发现尽早治疗为其治疗的关键，应用饮食疗法可以减轻或者控制患者症状［4⁃5］。

目前对苯丙酮尿症的检测方法有实验室诊断及其他等多种方法。实验室方法包括有Guthrie细菌抑制法、荧光光度法、Bio⁃Rad酶定量法等。Guthrie细菌抑制法、酶法和荧光光度法比较，细菌抑制法、酶法操作过程简便、快捷、成本低，不需要特殊设备而适于大规模检测苯丙氨酸的浓度，但准确性、精密度、灵敏度较低，荧光光度法检测快速、微量，其灵敏度和精确度明显高于细菌抑制法、酶法，但单个样本检测费时［3］。其他检查方法还有头颅核磁共振成像（nuclear magnetic reso⁃nance imaging，MRI）检查、脑电图、骨骼X射线表现、智力测定、氢质子磁共振波谱检测以及基因检测等方法［5⁃7］。而基因诊断与其他生化检测方法相比，其优势在于可从DNA水平上检测病因，诊断特异性高，在个体发育任一阶段，对任何含完整遗传物质的细胞都可进行诊断，并且可为产前诊断和潜在的新治疗方法研究提供可参考的依据。

基因诊断技术包括有PCR及其衍生技术、短串联重复序列（short tandem repeat，STR）分析技术以及基因测序技术。此3种方法相比，PCR及其衍生技术的可重复性及准确性均有不足，不能明确碱基变异的具体位置与形式，也不能区分基因的多态和突变位点。STR方法虽经济快速，但其仅适用于STR可提供连锁信息的家庭。而测序技术不仅能检测出已知突变位点，还能发现新的SNP位点，且Sanger一代测序技术则成为分析基因序列的金标准。但是一代测序技术成本高、技术难度系数大，很难在基层推广，而近年来发展起来的以芯片测序、合成测序和焦磷酸测序为代表的下一代测序技术（nextgeneration sequencing，NGS）能弥补一代测序的不足，可实现快速、通量高的规模化测序。以Ion Torrent PGMTM（个体基因组测序仪）以及更高通量的Ion Torrent ProtonTM测序仪为代表的半导体测序技术，其不属于荧光检测、核酸标记的生化技术，与其他下一代测序技术相比更简单、性价比更高，并且具有强大的扩展性［8⁃9］。本研究拟采用高通量的半导体测序技术对苯丙酮尿症多个常见致病突变点进行检测，探讨半导体测序技术在遗传病检测中应用的可行性。

1 材料和方法

1.1 实验对象

实验所用干血斑样本共75例，是2016年3月份在河南地区收集的新生儿筛查样本。

1.2 DNA提取

采用MagPure Blood DNA M ini FTA Kit［广州美基（欣研）生物科技有限公司］提取血斑基因组DNA，操作按试剂盒的说明书进行，提取完成后，用Qubit®3.0荧光计（Life Technologies）检测DNA浓度，随后-20℃保存。

1.3 半导体测序

1.3.1 文库构建

表1 12个常见突变点详细信息Table 1 The details of 12 commonmutations

根据GeneBank中的PAH序列（GI：568815586），由Life Technologies针对致病突变点（表1）设计合

成引物Panel，包含2个引物池，2个引物池分开进行多重PCR扩增，扩增体系为10μL，反应条件为：99℃预变性2m in；99℃变性15 s，60℃退火和延伸4min，共19个循环；10℃保温。扩增产物经FuPa酶消化引物，用DNA连接酶将特异性接头序列连接在目的片段两端，磁珠纯化后进行一步扩增反应，最后经两步磁珠纯化去除较大或较小的片段，构建成片段大小在250 bp左右的基因文库。Qubit®3.0荧光计对文库浓度进行定量。

1.3.2 模板制备和模板富集

建好的文库等量混合使每个文库的终浓度为200 pmol/L。用Ion TorrentOTTM进行乳液PCR扩增，将Ion PGMTMEnzyme M ix 50μL、Ion PGMTMISPs 100μL、稀释好的文库2μL和无核酸酶水248μL加入到PGMTMMaster M ix中，此时体积共1 000μL，震荡离心后匀速缓慢注入到Ion One⁃TouchTMReaction Filter中，并分2次注入1.7 m L Ion One TouchTMReaction Oil，此过程避免注入气泡，将Ion One TouchTMReaction Filter安装在Ion OneTouchTM2上，选择相应程序进行反应。模板制备完成后用One TouchTMES进行模板富集。

1.3.3 Ion TorrentPGMTM测序

用Ion Torrent PGMTM测序仪进行测序反应，首先进行仪器的氯洗和水洗，然后更换初始化芯片进行初始化反应以调节各位置的pH值在7.45～7.60范围内，将ES制备的模板Loading到318芯片上，安装在测序仪相应位置，选择预先设置好的Plan（见表2），根据说明书设定测序的所需的flow数和上样量，本实验所检测的文库片段大小为250 bp，所需flow数为500，进行测序反应。测序结束后在Ion Torrent服务器上运行插件分析每个样本的10个致病位点的突变情况。

表2 Plan的参数设置Table 2 The parameter setting of the plan

1.4 Sanger测序

将DNA样本及相应的引物打包送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行Sanger一代测序验证。

1.5 结果判断及统计学方法

试验结果统计分析选用符合方案数据，即所有符合试验方案要求的受试者样本数据进行统计分析，主要采用四格表整理试验数据，阳性代表检测出的含12个致病突变点中一个或多个致病位点的样本，阴性代表没检测出这12个致病突变点的样本。半导体测序结果和Sanger一代测序验证结果对比采用Kappa一致性检验。

2 结果

2.1 半导体测序结果

半导体测序结果显示，75个样本中共检测出57例样本存在致病突变位点，都为单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNP）位点，包括有杂合突变、纯合突变以及复合杂合突变，其中杂合突变的Frequency在39～56.4之间，纯合突变的Frequency在94.7～100之间，Coverage在30～1 449之间，大部分落在200～600之间，平均Coverage为470。具体信息见表3。

此处野生型指未检测出12种常见PAH基因致病突变的型别。

2.2 Sanger测序结果

采用Sanger测序法对检测出的突变样本的突变点进行验证，各被检测标准本中突变位点的检测结果与半导体测序结果完全一致。

2.3 统计学分析结果

试验真实性评价：灵敏性、特异性、准确性、Kappa值等指标计算，见表4。

分别计算灵敏性、特异性、准确性：

灵敏性=57/（57+0）×100％=100％

特异性=18/（0+18）×100％=100％

准确性=（57+18）/（57+0+0+18）×100％=100％

Kappa值采用SPSS 15.0统计软件进行统计分析。Kappa值的计算结果都为1，结果表明，半导体测序结果与Sanger一代测序验证结果完全一致。

3 讨论

PKU是现阶段人类了解较为清楚的遗传代谢病之一，并且是首个可通过饮食控制实现治疗的遗传病，对此病进行早发现、早确诊、早干预、早治疗，对降低PKU患儿致残率，提高国民素质，具有重大意义。此病具有致病基因为纯合或双重杂合时发病的特点［10］，且此病各地区突变热点存在较大差异。

表3 75例样本检测结果表Table 3 75 casesof sample test result

表4 2种方法检测结果的一致性评测表Table 4 The consistency of the testing results of the 2methods

本实验中我们用Ion TorrentPGMTM半导体测序仪对苯丙酮尿症常见的12个致病突变位点进行检测，75例样本中共检测出57例样本突变，其中46例样本为单个位点突变，11例样本为含2种突变类型的复合突变，包含有11种突变类型，且728G＞A为河南地区高发突变点［10］，除此高发热点外，其他突变点在检出的数量上并无明显差异，也进一步反映出苯丙酮尿症突变异质性高，并无绝对突变热点的特征。本实验结果经一代测序验证，结果准确，此外曾有文献报道Ion Torrent半导体测序在其他致病突变的检测，如成建等［11］应用Ion Torrent半导体测序技术检测马凡综合征患者FBN1基因致病突变点，检测到3个马凡综合征家系和1个马凡综合征的致病基因突变，Sanger验证结果与半导体测序结果完全一致；周保成等［12］提取15例确诊为经典型PKU患儿及其父母的外周血DNA，应用Ion TorrentPGMTM进行测序检测，共检测出29个突变点，分属17种突变，并发现p.P292L的新突变点，且该检测结果与Sanger验证结果一致。这些研究作为半导体测序技术应用于遗传病检测的强有力的证据，表明高通量的半导体测序技术应用于遗传病检测的可行性。

在看到实验成功的同时，我们也应注意实验数据所反映出的不足之处。本实验所测得的有几个突变样本Coverage值较低，且最大值与最小值相差较大，实验结果的准确性虽经一代测序验证，但较低的Coverage值，令结果缺少说服力。究其原因，我们可以从实验结果原始数据可以看出，样本DNA浓度偏低，进而使建库浓度偏低且各样本文库浓度差别大，而较大的浓度差别，易造成混样的不平均，最终在测序结果处体现出样本间Cov⁃ erage差别大。针对这些问题，我们可以从以下几个方面进行解决：（1）优化DNA提取方法或针对不同类型的样本选取更合适的DNA提取试剂盒；（2）对于同一批上机样本，其浓度的测定及混样应由同一个人一次性操作完成，尽量减小误差；（3）提升实验人员的实验操作技能。

此外，我们也应认识到，下一代测序技术也只是一项技术，而若将其应用于疾病检测领域，不仅需要有野生型的序列作为对照，还需要明确疾病的致病机制及确切的致病突变点，而且后期还要进行大量的数据分析处理工作，只有各环节的工作都做好了，对疾病的确诊才有意义。

伴随着下一代测序技术的高速发展，我们坚信所面临的难题将会逐步解决，下一代测序技术将在在遗传病检测领域发挥更重要的作用。

［1］王国强，岳邦振，何彩菊，等.新生儿苯丙酮尿症筛查结果分析［J］.大家健康：学术版，2012，6（10）：2-4.

［2］卢建强，熊继红.新生儿苯丙酮尿症的筛查与防治概况［J］.检验医学与临床，2013，10（7）：856-858.

［3］银雪花，阳利龙.苯丙酮尿症筛查检测方法进展［J］.儿科药学杂志，2007，13（6）：61-63.

［4］贾晓菲.苯丙酮尿症常见突变位点检测及中国人群PAH基因突变谱的调查［D］.厦门：厦门大学，2014.

［5］杨志峰.苯丙酮尿症的临床研究进展［J］.中国现代医药杂志，2012，14（2）：131-132.

［6］张瑞，周铁成，郝晓柯，等.高效液相色谱法及串联质谱法在苯丙酮尿症筛查诊断中的应用［J］.国际检验医学杂志，2015，36（6）：758-759，762.

［7］李艳霞，潘迎.新生儿筛查苯丙酮尿症实验方法学进展［J］.中国儿童保健杂志，2011，19（9）：824-826.

［8］刘宇轩，张文琼，黄代新.测序新技术Ion Torrent PGM及其法医学应用［J］.中国法医学杂志，2015，30（1）：52-55.

［9］朱艳慧.Ion Torrent测序技术检测Ⅰ型神经纤维瘤病患者NF1基因突变［D］.长沙：中南大学，2014.

［10］赵跃，张宏，夏雪山.下一代半导体测序技术在遗传性心肌病分子诊断中的应用［J］.遗传，2015，37（7）：635-644.

［11］成建，马定远，刘邺，等.应用IonTorrent半导体测序检测马凡综合征患者FBN1基因致病突变［J］.现代妇产科进展，2015，24（3）：201-204.

［12］周保成，穆原，尹婷，等.Ion Torrent PGMTM测序仪检测苯丙酮尿症患儿苯丙氨酸羟化酶基因突变［J］.临床检验杂志，2014，32（12）：898-902.

Screening of the phenylketonuria of the newborn by the next generation sequencing

WANG Huifang1,YEQianping1,YANG Xu2,LIANG Zhikun1,HU Niya3★
(1.Guangzhou Darui Biotechnology Co.,Ltd.,Guangzhou,Guangdong,China,510665;2.School of Basic Medical Science,Southern Medical University,Guangzhou,Guangdong,China,510515;3.Department of Clinical Laboratory,the Hospitalof Nanchang University,Nanchang,Jiangxi,China,330006)

Objective To sequence common pathogenic mutations which are related to phenylketonuria by using the next generation sequencing method,and evaluating the application value of Semiconductor sequencing in the field of hereditary disease detection.Methods Target geneswere captured by AmpliSeq technology,which are based on multiple PCR,and the captured fragments were used for construction of the DNA libraries,which were sequenced by using the Ion Torrent PGMTMsequencing platform. Themutations were verified by Sanger sequencing.Results There were 57 samples w ith mutations in 75 samples,and 10 mutations were detected.These mutations included a heterozygous mutation,homozygous mutation,and compound heterozygous mutations.Conclusion Sem iconductor sequencing can detect the common mutations of the phenylketonuria accurately,which can be used for mutation detection of these hereditary diseasesand to illuminateof the pathogenesisof these disorders.

Phenylketonuria;Semiconductor sequencing;Ion Torrent PGMTM;Genemutation;PAH gene

广州市科技计划项目（201504301001493）；广州市科技计划项目健康医疗协同创新重大专项（201508020259）

1.广州市达瑞生物技术股份有限公司，广东，广州510665 2.南方医科大学基础医学院，广东，广州510515 3.南昌大学第一附属医院临床科室，江西，南昌330006

★通讯作者：胡妮娅，E⁃mail：364621603@qq.com