下一代测序技术在遗传病临床检测中的应用

杨学习

·述评·

下一代测序技术在遗传病临床检测中的应用

杨学习★

DNA测序技术已广泛应用于生物学研究，很多生物学问题也都可以借助测序技术予以解决。过去10年（2005⁃2015年），下一代测序技术（nextgeneration sequencing，NGS）逐步从新技术成长为主流的测序技术，并逐渐走进临床诊断领域。NGS以其简单、快速、高分辨率、高通量的特点，在传染性疾病防控、肿瘤的早诊早治、遗传病的早期筛查和诊断、无创产前筛查、胚胎植入前诊断和筛查等领域发挥越来愈大的作用，已成为目前临床领域最具有应用前景的技术之一。同时下一代测序技术领域仍在快速发展，新的测序技术及数据分析技术还在不断涌现，序列数据库和测序数据快速增加。下一代测序技术也有助于以更低廉的价格，更全面、更深入地来分析基因组、转录组及蛋白质相互作用组的各项数据。可以预见，各种测序将成为一项广泛使用的常规实验手段，有望给生物医学研究领域和医学临床诊断带来革命性的变革。本文主要针对下一代测序技术在无创产前诊断、遗传病检测、胚胎植入前诊断和筛查中的临床应用进行介绍和评述。

下一代测序；染色体非整倍体无创产前筛查；遗传病检测；胚胎植入前诊断和筛查

DNA测序技术是生命科学领域里一项创造性的发明，从早期基于Sanger法开发的第一代自动化测序仪到下一代测序（next generation sequenc⁃ing，NGS）技术平台的发展，已经使生命研究的基本元素发生了转变——从单一、局部的基因或基因的片段转变成多基因、多片段甚至整个基因组；反过来，这种转变又需要更加强大的测序技术来支持，测序技术与其应用之间的协同关系使得两者的发展在可预见的未来内保持这种趋势，并且为其对生命科学研究和临床应用的巨大前景的推动作用而加速。

近几年国内NGS市场异常火爆，测序公司不断涌现。而且已有多家NGS公司迅速涌入临床领域，开展基于NGS的临床检测服务，如：染色体非整倍体无创产前筛查、百种甚至千种遗传病产前诊断、肿瘤个体化治疗相关基因多态性位点检测、单基因和多基因疾病的易感基因遗传检测和咨询等项目。2014至2015年，国家食品药品监督管理总局（China Food and Drug Adm inistration，CFDA）先后批准了华大基因、中山大学达安基因股份有限公司、北京博奥晶典生物技术有限公司和北京贝瑞和康生物技术有限公司的高通量测序仪和测序试剂，使染色体非整倍体无创产前诊断成为现实，开创了高通量测序在临床应用中的新局面并引起了社会的广泛关注。多家公司相继启动基于NGS测序技术的包括肿瘤靶向用药及疗效相关基因位点检测、遗传病筛查和诊断、胚胎植入前诊断和筛查相关试剂盒的CFDA注册工作。同时，以华大基因、中科紫鑫科技有限公司、深圳华因康基因科技有限公司、深圳市瀚海基因生物科技有限公司、上海小海龟科技有限公司为代表的公司也积极研发具有自主知识产权的基因测序仪。在不远的将来，NGS将成为一项广泛使用的常规实验手段，有望给生物医学研究领域和医学临床诊断带来革命性的变革。本文将主要针对NGS技术在无创产前诊断、遗传病检测、胚胎植入前诊断和筛查中的临床应用进行介绍，以示其较为系统的面貌。

1 NGS在染色体非整倍体无创产前诊断中的应用

染色体非整倍体无创产前诊断是NGS在临床应用上的一个成功典范，极大地推动了NGS在临床中的应用和发展。染色体非整倍体是最主要的胎儿染色体异常遗传性疾病，以21三体、18三体和13三体为主要形式。目前非整倍性染色体疾病尚无有效治疗方法，唯一有效的措施为广泛开展产前筛查与诊断［1］。但常规唐氏综合征产前筛查普遍存在假阳性和假阴性较高的问题，且通过羊膜穿刺和胎儿绒毛取样获得胎儿DNA通常会造成1％的流产率［2］。1997年，在孕妇血浆和血清中发现了胎儿游离DNA片段［3］，这为无创性产前基因检测带来新的希望。2008年，首次通过对母亲血浆胎儿游离DNA（cell⁃free fetal DNA，cffDNA）进行NGS分析来检测三体［4⁃5］，随后大样本研究表明利用NGS技术进行染色体非整倍体的无创产前诊断非常有效［6］。因其具有无创取样、无流产风险、高灵敏度、高准确性（≥99％）等特点，通过采集孕妇外周血、提取游离DNA、采用NGS技术、结合生物信息分析这一方法，已成为目前染色体非整倍体产前筛查与诊断技术的主要手段。多个联盟组织［例如，美国妇产科医师协会（the American College of Obstetricians and Gynecologists，ACOG），美国医学遗传学会（the American College of Medical Genet⁃ics and Genom ics，ACMG），国际产前诊断学会（the International Society for Prenatal Diagnosis，ISPD）］正在极力推进这项技术的临床应用［7⁃9］。在看到NGS技术强大能力的同时，我们也必须清醒地意识到胚胎胎盘不一致，嵌合体、胎儿DNA浓度、孕妇本身携带微缺失微重复或患有妇科肿瘤、双胎消失综合征等原因对该技术临床应用带来的局限性。尤其是胎儿DNA在母体血浆的浓度是影响检测结果的常见因素。胎儿DNA在母体血浆中的浓度一般为10％～15％，但也可能少于3％或多于30％［10⁃11］，在胎儿DNA浓度少于3％的样本中使用NGS技术其结果是不太可信的。另外，胎儿DNA浓度在3个方面影响着染色体非整倍体诊断的应用。首先，当胎儿DNA浓度增加时，唐氏综合征的结果也会更显著。其次，胎儿DNA浓度受孕妇体重影响最大，对于体重较大的孕妇，胎儿DNA浓度会低，假阴性比率会增高。最后，在嵌合体中，胎儿DNA浓度的有效部分会减少，这也会影响检测的准确性。

2 NGS在遗传病检测中的应用

NGS相对于传统的Sanger测序法有很多优

点，最明显的是它可以在较短的时间和较低的成本下做批量检测（panel testing）。对于许多表型上类似但由很多不同遗传因素造成的遗传异质性疾病（如遗传性耳聋、先天性肌营养不良、先天性疾病糖基化），以及在同一个通路中不同的基因突变所导致的代谢性疾病全部突变的筛选、有很多变量却有相同靶标的一系列疾病（如线粒体缺陷），NGS是一个有时间和成本效益的技术工具［12⁃14］。下文将通过简短介绍基于下一代测序技术的几种遗传性疾病和相应的基因检测试剂盒（panel），讨论下一代测序技术在遗传性疾病检测中的进展以及探讨怎样通过下一代测序技术来解决遗传异质性的问题。

2.1 遗传性耳聋

耳聋是最常见的感觉神经性听力损失出生缺陷疾病。大约2/3的耳聋来源于遗传因素，而剩余的1/3来源于环境［15⁃16］。常规芯片和核酸质谱筛查未能发现的阳性样本，对造成听力缺陷的所有基因进行测序是经常采用的方法。绝大部分的实验室对候选基因的编码区和两侧序列用Sanger测序法来进行检测。然而，听力缺陷极大的遗传异质性导致用Sanger测序法将耗费大量的金钱和时间。而NGS技术则可以对大量基因序列进行便宜、快速的多重平行测序。

Shearer等［17］设计的综合性诊断平台可以检测包括先天性聋视网膜色素变性综合征在内的54个已知的非综合征型耳聋基因。在6个突发性非综合征型耳聋病人里有5个病人在STRC、MYO6、KCNQ4、MYN14和CDH23上发现了非综合征型耳聋突变位点，包括3个新的突变位点。Licastro等［18］设计的Usher综合征基因的诊断panel在12个Usher综合征患者中的10例中检测到位于MY07A、CLRN1、GPR98、USH2A和PCDH15中的11致病突变。另外2个研究小组则分别设计了针对34个常染色体隐性遗传性非综合征型耳聋基因和24个神经性耳聋基因的检测panel［19⁃20］。Siva⁃kumaran等［19］通过与5个基因（GJB2，CDH23，MYO7A，EYA1和OTOF）394个变异位点的Sanger法鉴定结果对比，NGS和Sanger法的一致性高于99.99％。Schrauwen等［20］设计的panel中，24人中9人被确诊，达37.5％。6个患者被发现是纯合子变异，3个患者为复合杂合子变异。结果还显示一位患者可能具有OTOF和SLC26A4双基因型遗传模式［19］。

2.2 遗传性神经肌肉障碍

遗传性神经肌肉障碍（inherited neuromuscular disorders，NMD）是一组导致长期残疾的遗传性疾病，包括超过200种单基因疾病。在这些疾病中，有超过一半的分子机制目前尚不清楚。如果想要准确诊断，通常需要结合临床表现进行大规模一个接一个的基因检测。由于遗传异质性和散发病例缺少等位基因的分离，想要做出诊断十分昂贵、耗时并具有挑战性。NMD关联基因众多，还有一些致病基因特别长，从而使整个基因进行Sanger测序耗时耗力。对于病人来说，这种逐个基因排查法进行病因诊断，增加了检测数，因此会导致诊断的延迟、并使病人接受不必要的检查和治疗，还妨碍了采取针对性有效治疗方案的实施从而增加了疾病在家族中再发的风险。

Vasli等［21］开发了一种有效的筛查遗传异质性神经肌肉疾病相关基因的panel，包括267个已知的NMD相关基因（1.6Mb目的区域）。在已鉴定的病人和没有进行分子诊断的病人中，检测到了所有已知的突变位点［21］。在8个阳性对照组中，所有的突变类型都被检查到。在一例杜氏肌肉萎缩病人检测到了DMD（duchennemuscular dystro⁃phy）基因18～44外显子的大片段缺失。在2个共济失调的患者中发现存在于SETX的2个突变。还在RYR1、TTN和COL6A3上发现了几个潜在致病性突变位点，并通过Sanger测序和等位基因分离证实［21］。但Vasli等［21］未能在4个分子诊断不清楚的病人中寻找到致病基因。Xie等［22］通过panel测序对DMD基因突变进行检测，在一个中国家系（包括先证者以及先证者已被诊断出假肥大型肌营养不良的堂兄弟）DMD第79号外显子上发现了2个相同的突变位点，其中c.10141C＞T、NM_ 004006.1是其致病性突变，会产生缺失羧基端的截短的肌营养不良蛋白。Valencia等［23］则针对先天性肌营养不良（congenitalmuscular dystrophy disor⁃ders，CMD）进行panel检测，包括12个基因的321个外显子（65 kb目的区域）。以一个12个CMD基因都通过Sanger测序验证的正常人作为阴性对照，5个具有已知突变的样品作为阳性对照，6个具有CMD临床特征但尚未进行CMD基因检测病人作为研究对象，其诊断率为41％，而单基因检测的诊断率为17％。杜氏肌营养不良和Becker型肌营

养不良是最常见的儿童肌营养不良症［24］，可以通过对DMD基因进行基因检测来确诊。Lim等［25］设计的panel可对DMD/BMD进行全面性的突变谱研究。研究对象包括25名患者，其中16名无大片段缺失/重复但患有肌营养不良蛋白表达缺陷的患者，9名是存在大片段缺失/重复的患者。在大部分（15/16）没有大片段缺失/重复的患者中都检测到小的突变。以这16个患者作为基准，准确地预测出了9名已知突变患者的外显子大片段缺失/重复。16名患者中有15名检测到致病性突变，突变检测率及突变类型（12个无义突变，2个引起移码突变小缺失，和一个剪接突变）与对照方法得到的结果一致。

2.3 线粒体疾病

线粒体疾病的临床表现多样，遗传方式独特，可由核或线粒体基因组的突变引起［26］。已发现约有70个核基因与线粒体疾病有牵连，但仍有许多基因未知。由于线粒体疾病常表现为非特异性，因此同时检测m tDNA和nDNA的基因突变是有意义的。Vasta等［27］设计的包含线粒体基因组以及额外的1 000个核基因的panel，通过对42例具有线粒体氧化磷酸化临床及生化特征的无血缘关系幼儿患者的检测，发现55％（23/42）患者含有隐性基因或致病突变的m tDNA变异体，其中10例患者（24％）可以确定具有与疾病相关的基因突变，13例患者（31％）具有尚不明确的核基因突变。表明NGS技术应用于线粒体相关疾病的临床诊断十分具有潜力。

与传统的通过Sanger逐步测序检测关联基因的检测方法相比，基于NGS panel设计具有成本和速度优势，适用于多个潜在候选致病基因的高度遗传异质性疾病和由于同一个超大基因多个致病突变位点引起的单基因病的分析。基于panel的NGS方法的不足在于它不是包含所有与疾病相关的基因和基因区域，这是由于目的片段大小的限制或者刚被发现的未包括在panel上的疾病相关基因。全外显子测序和全基因组测序有可能可以对没有明确分子诊断病人中找到致病突变和/或基因，这些可以增加到现有的panel中去。然而与靶向panels相比，作为常规的分子诊断方法，全基因组或者全外显子组的方法要有更高的覆盖度，并且会降低敏感性和异质性的评估能力［28］。而在低覆盖率下测序更多的基因将会增加假阴性的风险，增加假阳性位点的个数，而这些假阳性位点又需要漫长的时间来验证。综合考虑目前panel检测的目的区域覆盖度、敏感性和特异性，目前panel测序还不能够完全替代Sanger测序。把Sanger测序法作为验证和补充技术是非常必要的。另外，要将panel测序运用到临床，还需要依据具体的捕获方法和测序平台确定每个panel的敏感性和特异性。

3 NGS在胚胎植入前遗传学筛查中的应用

胚胎植入前遗传学诊断（preimplantation genet⁃ic diagnosis，PGD）/胚胎植入前遗传学筛查（preim⁃plantation genetic screening，PGS）是指在体外受精过程中，对具有遗传风险患者的胚胎进行种植前活检和遗传学分析，以选择无遗传学疾病的胚胎植入宫腔，从而获得正常胎儿的诊断方法，可有效防止有遗传病患儿的出生。不孕不育已成为当今影响人类繁衍和家庭问题的疾病之一，试管婴儿技术给不孕不育夫妇们带来了希望。但通过试管婴儿方法获得的胚胎40％～60％存在染色体异常［29⁃30］，而染色体异常是导致妊娠失败和自然流产的主要原因，也是体外受精最终失败的主要原因之一［31］。健康的胚胎是试管婴儿成功的第一步，植入前遗传学筛查技术也因此越来越受到重视。

PGS/PGD的通用检测手段包括PCR、荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH），比较基因组杂交（array comparative genom ic hybrid⁃ization，aCGH）、NGS技术等。其中aCGH、单核苷酸多态性（single⁃nucleotide polymorphism，SNP）关联分析以及NGS使得检测结果更为准确。联合应用单细胞全基因组扩增技术和NGS可以同时检测单基因病和染色体非整倍性，准确率超过了99％［32］。2014年，世界首例经NGS进行单基因遗传病筛查的试管婴儿，在北京大学第三医院诞生［33］。北京嘉宝仁和医疗科技有限公司、贝瑞和康生物技术股份有限公司、江苏亿康基因科技有限公司、安诺优达基因科技（北京）有限公司、苏州贝康医疗器械有限公司等相继通过第三方检验、科研合作等方式为生殖中心提供PGS/PGD服务。2016年，CFDA相继通过了杭州贝瑞和康基因诊断技术有限公司、北京中仪康卫医疗器械有限公司（北京嘉宝仁和医疗科技有限公司全资子公

司）、苏州贝康医疗器械有限公司关于胚胎植入前染色体非整倍体检测试剂盒的创新医疗器械特别审批申请，表明PGS有望很快走入临床。而且随着测序技术成本大幅度降低、遗传学机制研究的推进和生物信息数据分析的深入，以及国家“全面二胎”政策发布和平均生育年龄的明显提升，基于NGS的胚胎植入前染色体非整倍体筛查会有更大市场空间。

4 结语

随着NGS的发展，更低成本和更快速度产生大量的测序数据终将提高对遗传性疾病的诊断效率。在最近的几年中，NGS向临床领域的转入速度正在稳步提升，特别在其绝对优势领域—检测由大量基因引起的遗传异质性疾病或者同时检测某个通路中的很多基因突变的应用上转化更快。我们相信，基于NGS的panel检测以及仍在快速发展的外显子组检测和全基因组检测在遗传性疾病的检测中将发挥更大的作用。

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Progressof the app licationsof next generation sequencing technology in clinical diagnosticsof genetic disorders

YANG Xuexi★
（School of Laboratory Medicine and Biotechnology，Southern Medical University，Guangzhou，Guangdong，China，510515）

DNA sequencing isw idely used in biology research,and many biological problems only can be solved by sequencing technology.In the past 10 years(2005-2015),next⁃generation sequencing has developed from a newborn technology to amainstream technology,and has been gradually applied to clinical diagnosis.W ith a simple,fast,high⁃throughput,and high⁃resolution feature,nextgeneration sequencing hasbeen believed to be one of the most potential technology in clinical tests,especially in infectious disease prevention, noninvasive prenatal diagnosis,genetic disorders identification and diagnosis,cancer early diagnosis and treatment,and preimplantation genetic screening field.Meanwhile,next⁃generation sequencing technology is still grow ing quickly,new sequencing and data analysismethods are constantly emerging,sequence database banks and sequencing data are rapidly increasing.Sequencing technology development lead analysis genome, transcriptome,and protein⁃protein interaction datamore deeply,comprehensively and cheaply.Sequencing w ill be a w idely used method in the routine lab test and w ill be a revolutionary change in biomedical research and clinical diagnosis.The presentpaperw illbriefly review the application of nextgeneration sequencing in the field of noninvasive prenataldiagnosis,genetic disordersdiagnosis,preimplantation genetic screening.

Next generation sequencing;Noninvasive prenatal diagnosis of chromosomal aneuploidies;Genetic disordersdiagnosis;Preimplantation genetic screening/diagnosis

广东省科技计划（2015A030401040）；广州市科技计划（201604020104）

南方医科大学检验与生物技术学院，广东，广州510515

★通讯作者：杨学习，E⁃mail：yxxzb@sohu.com