全细胞膜片钳技术检测化学损伤致痫大鼠海马脑片电生理特性

徐祖才 张 骏 黄 浩 王 静 徐忠祥 彭 燕 陈 娅 徐 平

(遵义医学院附属医院神经内科，贵州 遵义 563003)



·基础研究·

全细胞膜片钳技术检测化学损伤致痫大鼠海马脑片电生理特性

徐祖才 张 骏 黄 浩 王 静1徐忠祥 彭 燕 陈 娅 徐 平

(遵义医学院附属医院神经内科，贵州 遵义 563003)

目的 应用全细胞膜片钳技术检测化学损伤致痫大鼠海马脑片神经元基本电生理特性。方法 将成年SD大鼠建立氯化锂-匹罗卡品模型后，急性分离获得海马脑片，应用全细胞膜片钳电流钳技术实时观察化学损伤致痫大鼠海马脑片CA1区锥体神经元膜电位及其单位时间内动作电位频率的变化情况；通过全细胞膜片钳电压钳技术，检测化学损伤后大鼠海马脑片CA1区锥体神经元的诱发兴奋性突触后电流的变化情况。结果 急性分离所得海马脑片CA1区锥体神经元的胞体饱满并可见突起。可在大鼠海马脑片CA1区锥体神经元记录到自发的动作电位及刺激诱发兴奋性突触后电流，且化学损伤后神经元膜电位绝对值降低，动作电位频率加快，诱发的兴奋性突触后电流幅值升高。结论 全细胞膜片钳技术可以用于癫痫大鼠急性分离所得海马脑片的电生理研究，化学损伤后神经元兴奋性明显升高，为开展癫痫相关的功能研究提供了新的途径。

全细胞膜片钳；癫痫；海马脑片

癫痫的发作机制与神经系统递质紊乱密切相关〔1〕。近年来，脑片作为研究对象在神经科学领域应用越发广泛；目前可以通过急性分离及离体培养获得脑片，虽离体培养脑片较为稳定及存活时间佳，但急性分离脑片与动物的生理特性更加接近;随着电生理技术的不断发展，膜片钳结合脑片技术在神经系统疾病中的应用更是方兴未艾。虽然膜片钳的使用过程中对脑片中细胞活性及功能要求高，但笔者的前期实验已经证实，成年大鼠急性分离海马脑片可保存较好的生理学特性，且适于用与全细胞膜片钳技术的记录〔2〕。在前期实验基础上，笔者拟通过全细胞膜片钳技术，检测氯化锂-匹罗卡品致痫大鼠海马脑片CA1区神经元的基础电生理特性。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂 雄性成年SD大鼠，体重200 g，由重庆医科大学实验动物中心提供；Bicuculine、Nacl、Kcl、Cs-methanesulfonate、EGTA、HEPES、K2ATP、BAPTA、phosphocreatine、Na2ATP、Na3GTP及葡萄糖由美国sigma公司生产，其余配液所需常见分析纯级无机盐由重庆医科大学附属儿童医院儿研所提供。

1.2 实验器材 玻璃微电极(外径1.0 mm)由南京六合泉实验器材厂生产，P97 玻璃电极拉制仪由美国Shutter 公司生产，倒置相差显微镜及红外微分干涉相差显微镜由日本Nikon公司生产，MF-79 玻璃电极抛光仪由日本Narishige公司生产，Multiclamp 700B放大器、Digidata 1200转换器及数据分析软件Clampfit 9.2(膜片钳系统)由美国Axon公司生产，蠕动泵由美国WPI公司生产，恒温脑片孵育槽由美国Warner公司生产，NVSLM1型振动切片机由英国Campden 公司生产，95%O2+5%CO2混合气及100% N2由重庆朝阳气体供应公司供应。

1.3 方法

1.3.1 建立氯化锂-匹罗卡品化学损伤致痫大鼠模型及海马脑片急性分离 随机选取健康成年SD大鼠，以127 mg/kg的标准予以腹腔注射氯化锂注射(LiCl)；成功注射后20 h左右，以1 mg/kg的标准给予腹腔注射阿托品注射液；注射成功后30 min，再以50 mg/kg的标准予以腹腔注射新鲜配置的匹罗卡品；匹罗卡品药物注射后，对其行为学改变进行密切监视，对出现Racine评分〔3〕4～5级的，视为建模成功。 建模成功后24 h的大鼠用于海马脑片急性分离。参照之前实验步骤〔2〕，先配好相应的使用液体，其中切片液的主要成分如下：2.5 mmol/L KCl、6 mmol/L MgCl2·H2O、1 mmol/L CaCl2、1.25 mmol/L NaH2PO4、26 mmol/L NaHCO3、220 mmol/L蔗糖及10 mmol/L 葡萄糖；人工脑脊液(ACSF)主要成分：124 mmol/L NaCl、2 mmol/L CaCl2、2 mmol/L MgCl2、1.23 mmol/L NaH2PO4、3 mmol/L KCl、26 mmol/L NaHCO3及10 mmol/L 葡萄糖。冰镇切片液备用(冰水混合物，少量冰)，提前半小时使用95% O2+5% CO2的混合气将切片液及ACSF充气胞和，模型鼠以1 ml/100 g的3.5% 水合氯醛腹腔注射麻醉备用。断头取脑后，将海马组织置于切片机上，切成350 μm厚的海马脑片备用。正常大鼠海马脑片分离步骤相同。

1.3.2 动作电位及自发的兴奋性突触后电流(eEPSC)的记录 在全细胞膜片钳技术下，使用电流钳模式记录动作电位情况。其中记录动作电位电极内液的配方：60 mmol/L K2SO4、40 mmol/L HEPES、60 mmol/L NMG、12 mmol/L phosphocreatine、0.5 mmol/L BAPTA、4 mmol/L MgCl2、0.2 mmol/L Na3GTP及2 mmol/L Na2ATP。通过比较，分析化学损伤后海马神经元膜电位及其单位时间内动作电位频率的变化情况。使用电压钳模式记录eEPSC，其中记录自发eEPSC电极内液的配方：130 mmol/L Cs-methanesulfonate、10 mmol/L HEPES、10 mmol/L CsCl、4 mmol/L NaCl、1 mmol/L MgCl2、1 mmol/L EGTA、5 mmol/L NMG、5 mmol/L MgATP、0.5 mmol/L Na2GTP及12 mmol/L

phosphocreatine。使用正常的ACSF灌流记录，待得到稳定的数据后，进行采集分析。正常组及模型组海马脑片的记录模式一致，分析化学损伤后海马神经元在40 mV、20 mV、0 mV、-20 mV、-40 mV及-60 mV不同钳制电压下，eEPSC的变化情况。

1.4 膜片钳数据分析及制图软件 上述Clampfit 9.2可进行大部分的数据分析及制图，此外还应用到origin 8.5进行相关数据的分析和图片的处理。正常大鼠与癫痫大鼠膜电位及动作电位频率比较采用独立样本t检验，不同钳制电位下两组神经元eEPSC的幅值比较采用重复方差分析。

2 结 果

2.1 急性分离所得海马脑片形态学观察 急性分离所得癫痫大鼠海马脑片，直接肉眼视光泽度可，在显微镜低倍下观察，可发现海马CA1区锥体神经元结构清晰且呈线型；经红外处理后，在显示器上可见海马CA1区的锥体细胞外形饱满，且各细胞的突起清晰可见，该区的锥体神经元选择进行全细胞膜片钳记录时，易于封接。见图1。

图1 急性分离脑片海马CA1区锥体神经元

2.2 电流钳模式下记录动作电位 正常组和模型组的记录轨迹图见图2，分别对开始记录后5 min、20 min和35 min的轨迹图进行描记，发现在不同组别所记录神经元膜电位及每秒动作电位次数已趋于稳定，其中膜电位绝对值的比较，正常组(-63.83±0.70)较模型组(-51.67±0.67)降低(P<0.01)；每秒动作电位次数相比，模型组(14.83±0.48)较正常组(1.67±0.33)明显增多(P<0.01)。

图2 动作电位轨迹图

2.3 电压钳模式下记录诱发的eEPSC 在全细胞膜片钳技术的电压钳模式下，将电位分别钳制在40 mV、20 mV、0 mV、-20 mV、-40 mV及-60 mV的前提下，刺激强度为40 μS、60 μA及0.1 Hz (刺激电极为双极钨丝制成，距离胞体约150 μm)。整个记录过程使用ACSF+10 μmol/L Bicuculine灌流，即可记录到稳定的eEPSC，且在对应的不同钳制电位下，模型组的eEPSC的幅值较正常组明显升高(P<0.01，P<0.05)，见图3。

图3 不同钳制电位下正常组及模型组的eEPSC幅值

3 讨 论

癫痫是最常见的且具有致残性的神经系统疾病之一，且其发作也是不可预知的,在通常情况下癫痫患者需要长期甚至是终身使用抗癫痫药物治疗；此外，尽管现行抗癫痫药物治疗方案推广良好，但是，仍有相当部分患者最后成为药物难治性癫痫〔4,5〕。

随着药物难治性癫痫患者术前评估能力的不断提升以及手术技术的日趋改良，国内外相关患者接受手术治疗也越来越多，因此，以癫痫患者的手术切除标本为研究对象的实验研究也越来越多，发现脑组织中有异常表达的蛋白质，也包括一些离子通道蛋白〔6～8〕。此外，也有学者在癫痫患者脑脊液中发现了一些异常表达的蛋白,甚至提出这些异常蛋白即为与癫痫或是难治性癫痫相关的生物标记物〔9,10〕。

然而，任何异常表达的蛋白，与癫痫之间到底是因果关系还是伴随现象，试图通过人脑组织标本及脑脊液的相关检测不得而知，因此癫痫的动物实验被广泛使用以证实相关蛋白的作用机制。其中，氯化锂-匹罗卡品致癫痫大鼠模型，已被广泛使用于癫痫的发病机制研究〔11,12〕。然而，因动物在体膜片钳的推广程度首先以及全细胞膜片钳技术的广泛运用，使得寻找一种可以使用全细胞膜片钳技术而又能与癫痫动物模型相一致的脑片或细胞模型成为研究者们追逐的热点。其中原代海马神经元癫痫样放电模型被使用过，且也有一定的实验价值，然而，因其与动物在体模型缺乏一致性，而使得实验的相关性和延续性受限〔13〕。

因此，离体脑片，特别是能与在体动物保持一致性和延续性的成年大鼠脑片的使用，可以为癫痫相关蛋白功能的研究提供很好的研究对象〔2〕。本实验所提供的氯化锂-匹罗卡品癫痫大鼠的海马脑片制备过程可靠，所得脑片活性强，在全细胞膜片钳的封接过程顺利，且通过电流钳记录，发现化学损伤后海马锥体神经元的膜电位绝对值降低，从而兴奋性增加，通过与正常大鼠的对比分析，也证实了化学损伤后，神经元的动作电位频率明显加快。然而，虽然化学损伤后神经元兴奋性增加，膜电位绝对值降低，然而，神经元仍然可以被长时间稳定记录到动作电位。不同钳制电压状态下，检测一定强度电流刺激所得的eEPSC，发现虽然损伤后神经元在不同钳制电压下的eEPSC幅值均较正常大鼠升高，同样提示兴奋性增强，然而，仍然可以承受外源性电流的刺激，稳定记录到eEPSC。

1 Xu Z,Xu P,Chen Y,etal.ENT1 inhibition attenuates epileptic seizure severity via regulation of glutamatergic neurotransmission〔J〕.Neuromolecul Med,2015;17(1):1-11.

2 徐祖才，陈恒胜，刘 靓，等.膜片钳技术在成年大鼠海马脑片应用的初步研究〔J〕.重庆医科大学学报，2012;37(9)：799-801.

3 Wang L,Lv Y,Deng W,etal.5-HT6 Receptor recruitment of mTOR modulates seizure activity in epilepsy〔J〕.Mol Neurobiol,2015;51(3):1292-9.

4 Xu Y,Zeng K,Han Y,etal.Altered expression of CX3CL1 in patients with epilepsy and in a rat model〔J〕.Am J Pathol，2012；180(5):1950-62.

5 French JA.Can evidence-based guidelines and clinical trials tell us how to treat patients〔J〕? Epilepsia,2007;48(7):1264-7.

6 Zhu B,Zha J,Long Y,etal.Increased expression of copine Ⅳ in patients with refractory epilepsy and a rat model〔J〕.J Neurol Sci,2016;360:30-6.

7 Li Z,Mi X,Xiong Y,etal.Elevated expression of the delta-subunit of epithelial sodium channel in temporal lobe epilepsy patients and rat model〔J〕.J Mol Neurosci,2015;57(4):510-8.

8 Xi Z,Deng W,Wang L,etal.Association of alpha-soluble NSF attachment protein with epileptic seizure〔J〕.J Mol Neurosci,2015;57(3):417-25.

9 Xi ZQ,Wang X,Luo J,etal.Fibronectin is a potential cerebrospinal fluid and serum epilepsy biomarker〔J〕.Epilepsy Behav,2015;48:66-9.

10 Rong H,Jin L,Wei W,etal.Alpha-synuclein is a potential biomarker in the serum and CSF of patients with intractable epilepsy〔J〕.Seizure,2015;27:6-9.

11 Xu X,Yang X,Xiong Y,etal.Increased expression of receptor for activated C kinase 1 in temporal lobe epilepsy〔J〕.J Neurochem,2015;133(1):134-43.

12 Yang X,Xu X,Zhang Y,etal.Altered expression of intersectin1-L in patients with refractory epilepsy and in experimental epileptic rats〔J〕.Cell Mol Neurobiol,2015;35(6):871-80.

13 Xu ZC,Chen YM,Xu P,etal.Epileptiform discharge upregulates p-ERK1/2,growth-associated protein 43 and synaptophysin in cultured rat hippocampal neurons〔J〕.Seizure,2009;18(10):680-5.

〔2016-08-16修回〕

(编辑 曲 莉)

Electrophysiological properties in the chemical injury epileptic rat hippocampal brain slices examined by whole-cell patch clamp technique

XU Zu-Cai,ZHANG Jun,HUANG Hao,et al.

Department of Neurology,Affiliated Hospital of Zunyi Medical College,Zunyi 563003,Guizhou,China

Objective To observe the electrophysiological properties in the epileptic rat hippocampal brain slices by whole-cell patch clamp technique.Methods After epileptic rat model was successfully established,the hippocampal brain slices were acutely dissociated，whose basic electrophysiological properties were detected by whole-cell patch clamp technique.After chemical injury,the changing of membrane potential and action potential were recorded by the current clamp technique，and the changing of evoked excitatory postsynaptic current(eEPSC)was recorded by the potential clamp technique.Results On acutely dissociated hippocampal brain slices of epileptic rats,good physical shape and obvious neurite of pyramidal neurons in CA1 region could be observed.Spontaneous action potential and evoked excitatory postsynaptic current could be detected on pyramidal neurons in CA1 region by whole-cell patch clamp technique.After chemical injury,the neuronal membrane potential absolute value became lower and action potential frequency became faster.In addition,the eEPSC amplitude became higher.Conclusions The physiological activities of pyramidal neurons in CA1 region are high enough for sealing.In addition,the whole-cell patch clamp technique is suitable for detecting the electrophysiological properties.It is found that neuronal excitability increased significantly after chemical injury,which could provide a new pathway for the functional research of epilepsy.

Whole-cell patch clamp;Epilepsy;Hippocampal brain slice

国家自然科学基金(81260201，81560224)；贵州省科学技术基金资助项目〔黔科合J字(2013)2327号〕；遵义市优秀青年科技人才培养项目〔遵科合人(2014)10号〕；贵州省高校优秀科技创新人才支持计划〔黔教合KY字(2014)247〕；贵州省科技合作计划项目〔黔科合LH字(2015)7520号〕；贵州省卫计委科技基金(gzwjkj 2015-1-052)

徐 平(1963-)，男，博士，主任医师，主要从事癫痫及认知功能障碍研究。

徐祖才(1981-)，男，博士，副主任医师，主要从事癫痫的基础与临床研究。

R742.1

A

1005-9202(2016)21-5217-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.21.001