大蒜素对H9c2细胞钠电流的作用

杨易+董颖+陈晨+徐斌+但晴+李泱

【摘要】 目的 观察大蒜素（Gar）对H9c2细胞钠电流的影响。方法 取培养大鼠心肌细胞系H9c2细胞， 采用全细胞膜片钳记录钠电流。观察Gar对钠电流和门控机制的影响。结果 Gar对INa的抑制效应呈电压依赖性。-30 mV时， 200 μmol/L Gar可使INa由（-98.4±5.6）pA/pF降低为（-66.5±5.3）pA/pF （P<0.01）。药物使INa半激活电压V1/2向去极化方向移动， 减少通道开放， 从而减少INa电流峰值密度。200 μmol/L 的Gar可以使钠通道的稳态激活曲线向去极化方向移动， 半激活电压（V1/2， act）从（-50.6±5.4）mV移至（-27.8±3.2）mV（P<0.01）， 激活曲线斜率（kact）差异无统计学意义（P>0.05）。结论 大蒜素可能通过减少钠通道激活， 降低钠电流。

【关键词】 大蒜素；H9c2细胞；钠电流；膜片钳

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.27.192

【Abstract】 Objective To observe influence by garlcini （Gar） on H9c2 cell sodium current. Methods Sodium current in cultured H9c2 cells of rat cardiac muscle cell line was recorded by whole-cell patch clamp. Observation was made on influence by Gar on sodium current and gating mechanism. Results Inhibiting effect on INa showed its voltage dependency by Gar. With -30 mV， 200 μmol/L Gar decreased INa from （-98.4±5.6） pA/pF to （-66.5±5.3） pA/pF （P<0.01）. Peak value density of INa was reduced by medication which led INa half activation voltage V1/2 toward depolarization and reduced opened channel. Depolarization move of steady-state activation curve in sodium channel was induced by 200 μmol/L Gar. Half-activation voltage （V1/2，act） moved from （-50.6±5.4） mV to （-27.8±3.2） mV （P<0.01）. The difference of activation curve slope （kact） had no statistical significance （P>0.05）. Conclusion Garlcini can reduce sodium current by decreasing sodium channel activation.

【Key words】 Garlcini； H9c2 cell； Sodium current； Patch clamp

心律失常是最常见的心血管疾病之一， 而心肌细胞钠离子通道电流在心肌电活动中起着主要的作用。其不仅贡献动作电位的0相除极， 也决定着心肌细胞的有效不应期， 该通道突变可以导致Brugada综合征、LQT3和家族性房颤等多种遗传性心律失常[1， 2]， 钠通道也是一类抗心律失常药物的作用靶点。然而， 一类抗心律失常药物多具有副作用， 从而制约了它们的应用[3]。亟需寻找新的抗心律失常药物。Gar是一种从百合科植物大蒜鳞茎中分离出的具有多种生物学活性的化合物。在心血管疾病领域的应用越来越受到重视， 该成份可以改善缺血心肌的供养， 具有抗心律失常作用[4]。本文选择大鼠心肌细胞系H9c2细胞， 用全细胞膜片钳技术观察Gar对INa的影响， 以期为开发新的抗心律失常药物提供实验依据。

1 材料与方法

1. 1 材料 胰蛋白酶、牛血清白蛋白、天门冬氨酸钾、丙酮酸钠、MgATP、HEPES、CaCl2、CdCl2、TTX均为Sigma公司产品；EGTA购自Fluka Biochemika；DMEM-F12培养基和胎牛血清购自美国 Gibico公司。

细胞外液（mmol/L）：NaCl 130， CaCl2 2， CsCl 5， MgCl2 1.2， HEPES 10和glucose 5， CsOH调pH至7.4。于细胞外液加入4-AP 5 mmol/L阻断Ito。

细胞内液（mmol/L）：CsCl 100、TEA-Cl 20、EGTA 10、Na2-ATP 5、HEPES 10， CsOH调pH调至7.2。

1. 2 H9c2细胞的培养 H9c2 心肌细胞由中山大学实验动物中心提供。在37℃、5% CO2 条件下培养于含有15%胎牛血清的 DMEM-F12培养基中。0.25% 胰蛋白酶消化细胞， 制成细胞悬液。将细胞接种在直径为1.4 cm的盖玻片上， 37℃培养贴壁。

1. 3 药物及应用 Gar购于上海禾风制药有限公司， 纯品是无色或淡黄色油状物， 相对分子质量为162。临用时用细胞外液制成终浓度， 细胞外恒流灌流方式给药。

1. 4 全细胞膜片钳记录 将Axon-700B膜片钳放大器（USA）同计算机连接。刺激信号及电压输入信号的采集应用Digidata 1550A数模转换器（USA）， 均由软件（pCLAMP10.4） 控制。GG-17玻璃毛坯经pp-83微电极拉制仪（Narishige Co. Japan）拉制成电阻为2.0～5.5 MΩ的电极。调节三维操纵器进行封接， 使封接电阻达>1 GΩ， 吸破细胞膜形成全细胞记录模式。为消除细胞间的误差， I值以电流密度（pA/pF）表示。

1. 5 统计学方法 采用SPSS17.0统计学软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2. 1 大蒜素对H9c2细胞INa及电流电压曲线的作用 30 mV时， 钠峰电流密度（-98.4±5.6）pA/pF， 200 μmol/L Gar使电流密度降低为（-66.5±5.3）pA/pF， 比较差异具有统计学意义（P<0.01）。电流-电压曲线显示， 通道约在-70 mV激活， 峰值电位在-30 mV， 曲线呈陡峭倒钟形。200 μmol/L 的Gar使各电压下电流均被抑制， 尤其是-40～0 mV内电流降低更为明显。不同浓度Gar作用于INa的原始记录图。见图1A。200 μM Gar 对INa电流峰值密度的作用。见图1B。

2. 2 大蒜素对H9c2细胞INa稳态激活和稳态失活曲线的影响 200 μmol/L 的Gar可以使钠通道的稳态激活曲线向去极化方向移动， 半激活电压（V1/2， act）从（-50.6±5.4）mV移至（-27.8±3.2）mV（P<0.01）， 激活曲线斜率（kact）差异无统计学意义（P>0.05）。应用Gar前后， 钠通道稳态失活曲线变化不大， 提示药物对通道的失活过程影响较小。对INa电压-电流曲线的作用。见图2A。Gar 对INa稳态激活曲线的作用。见图2B。

2. 3 大蒜素对INa失活后恢复动力学的影响 200.0 μmol/L Gar使通道恢复时间常数延长， 失活后恢复曲线右移。

3 讨论

本文发现， 大蒜素可以抑制心肌细胞系H9c2的INa， 使其电流密度降低。且随着药物浓度的增高， 其抑制效应增大， 半数抑制浓度约为85.5 μmol/L。因此， 具有一类抗心律失常药物的特征。另有报道， 其可以抑制大鼠心肌细胞ICa， L、IKr和Ito[5-10]， 可见其对离子通道电流的效应是多重的， 这较符合现代抗理想心律失常药物的特征。Gar抑制INa的效应在电流峰电位附近更加明显。

对通道门控机制和动力学分析发现， Gar主要从二个环节降低INa通道的开放， 即Gar可以使钠通道激活曲线右移， 从而延迟通道激活；Gar还可使钠通道失活后恢复时间延长， 从而减缓通道失活后的再次激活。这可能是其降低INa的机制之一。但本研究从细胞电生理角度解释了Gar抗心律失常的部分机制， 且该药物具有多通道抑制特点， 符合现代抗心律失常药物的理念[8]。

参考文献

[1] Zhang J， Yu C， Jie Y， et al. Electrophysiological and trafficking defects of the SCN5A T353I mutation in Brugada syndrome are rescued byalpha-allocryptopine. Eur J Pharmacol， 2014（746）：333-343.

[2] Kanters JK， Yuan L， Hedley PL， et al. Flecainide provocation reveals concealed brugada syndrome in a long QT syndrome family with a novel L1786Q mutation in SCN5A. Circ J， 2014， 78（5）：1136-1143.

[3] Justo F， Fuller H， Nearing BD， et al. Inhibition of the cardiac late sodium current with eleclazine protects against ischemia-induced vulnerability to atrial fibrillation and reduces atrial and ventricular repolarization abnormalities in the absence and presence of concurrent adrenergic stimulation. Heart Rhythm， 2016， 13（9）：1860-1867.

[4] 高迎春， 徐长庆， 刘学义， 等. 不同剂量大蒜素对糖尿病大鼠心律失常的影响. 齐齐哈尔医学院学报， 2011， 32（7）：1033-1034.

[5] Krumm P， Giraldez T， Alvarez de la Rosa D， et al. Thiol-reactive compounds from garlic inhibit the epithelial sodium channel （ENaC）. Bioorg Med Chem， 2012， 20（13）：3979-3984.

[6] 陈晨， 王禹， 张德贤， 等. 大蒜素对兔心房肌细胞超速激活延迟整流钾电流的作用. 中华老年多器官疾病杂志， 2013， 12（5）：381-386.

[7] 但晴， 赵颖， 吴志娟， 等. 大蒜素对自发性高血压大鼠心肌I_（to）重构的影响. 药学学报， 2015（1）：39-44.

[8] Mirams GR， Cui Y， Sher A， et al. Simulation of multiple ion channel block provides improved early prediction of compounds clinical torsadogenic risk. Cardiovasc Res， 2011， 91（1）：53-61.

[9] 巫少荣， 李自成， 余健， 等. 大蒜素对心室肌细胞膜钠通道电流的影响. 中国病理生理杂志， 2011， 27（4）：658-661.

[10] 李辉， 赵锴， 王磊. 大蒜素抑制H_2O_2诱导的心肌细胞凋亡的实验研究. 现代预防医学， 2016， 43（6）：39.

[收稿日期：2016-07-07]