利胆排毒方提取物的高效液相色谱指纹图谱研究Δ

张 凡， 崔瑞勤，黄必胜，李 娟，陈科力，曹 艳

(湖北中医药大学药学院，湖北 武汉 430065)



·论 著·

利胆排毒方提取物的高效液相色谱指纹图谱研究Δ

张 凡*， 崔瑞勤，黄必胜，李 娟，陈科力，曹 艳#

(湖北中医药大学药学院，湖北 武汉 430065)

目的：探讨利胆排毒方提取物的指纹图谱，为利胆排毒方的物质基础和质量控制研究提供一定依据。方法：采用Waters Cosmosil 5C18-MS-Ⅱ色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为乙腈(B)-0.1%磷酸+2%四氢呋喃水溶液(A)，梯度洗脱，流速0.8 ml/min，检测波长248 nm，柱温35 ℃，采用相关系数法对10批利胆排毒方提取物进行分析。结果：建立了利胆排毒方提取物的高效液相色谱指纹图谱，标定了19个共有峰，10批样品的相似度在0.984～0.997之间。结论：建立的方法准确、可靠，可用于利胆排毒方的物质基础研究和其新制剂开发时的质量控制。

利胆排毒方； 指纹图谱； 高效液相色谱法

利胆排毒方由茵陈、栀子、丹参等8味中药组成，是综合了大承气汤和茵陈蒿汤的临床应用从而加减而成，其医院制剂以口服液剂型用于临床，疗效较好，主要用于治疗感染、创伤、肠源性内毒素移位和功能性病变引起的内毒素血症[1-3]。课题组之前的研究以绿原酸为质量控制指标，测定成分单一，而中药复方是多成分、多靶点协调发挥作用的，因此难以全面控制利胆排毒方的质量[4]。目前，中药指纹图谱法已成为国际公认的中成药以及天然药物实现质量控制的最有效方法[5-6]。高效液相色谱指纹图谱是目前中药色谱指纹图谱研究的首选方法，其所提供的特征信息比其他方法更丰富、全面[7]。有研究对小承气汤[8]、茵栀黄注射液[9]、四物汤[10]、金茵清热口服液[11]等均采用了高效液相色谱指纹图谱的方法进行质量控制，尤其是丹参制剂相关指纹图谱研究相对成熟[12]，复方丹参滴丸的高效液相色谱指纹图谱已上升为《中华人民共和国药典：一部》(2015年版)的标准[13]。本研究对10批次药材制得的利胆排毒方提取物进行色谱特征谱的分析与探讨，为利胆排毒方的内在质量控制提供一种较全面的分析手段。

1 材料

1.1 仪器

UltiMate 3000型高效液相色谱仪(美国戴安公司)；Waters Cosmosil 5C-18-MS-Ⅱ色谱柱(美国Waters公司)；Anke TGL-16G型高速离心机(上海安亭科学仪器厂)；XS205电子分析天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]。

1.2 药品与制剂

绿原酸(批号：110753-201314)、栀子苷(批号：110749-201316)、丹酚酸B(批号：111562-201313)均购自中国药品生物制品检定所；乙腈(色谱纯，美国Tedia公司)；磷酸(优级纯)、四氢呋喃(色谱级)均购于国药集团化学试剂有限公司；利胆排毒方(自制)，10批次药材分别来自于武汉龙泰药业有限公司、湖北百草堂药房连锁公司、黄家湖医院药房、金世康大药房、老百姓大药房，每家各2批次。

2 方法与结果

2.1 供试品的制备

按处方量称取各味药材饮片，将大黄、金银花以外的组分用水煎煮3次，每次20 min，过滤后合并3次滤液，再加入大黄煎煮40～50 min，滤过，滤液浓缩至1/2作为备用液。另取金银花，用10倍量80%乙醇浸泡24 h后超声提取2次，每次1 h，过滤合并2次滤液，滤液浓缩至无醇味，得浓缩液。浓缩液转入备用液中继续浓缩至药液相对密度1.09(约含生药量0.5 g/ml)，加入95%乙醇至表观醇沉浓度为50%，于25 ℃下静置36 h后，5 000 r/min离心10 min，取上清液，回收乙醇，浓缩，真空干燥，得利胆排毒方提取物。密封保存。取适量该提取物，加蒸馏水使其溶解，每毫升相当于原药材1 g，即得供试品。

2.2 混合对照品的制备

取干燥至恒质量的绿原酸、栀子苷、丹酚酸B对照品分别精密称取6.14、6.11、8.71 mg，分别置于25 ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，得每1 ml含绿原酸、栀子苷、丹酚酸B 245.6、244.4、348.4 μg的贮备液。再分别取3种对照品贮备液各3 ml，置于10 ml容量瓶中，定容至刻度，即得混合对照品溶液。

2.3 色谱条件

采用Waters Cosmosil 5C18-MS-Ⅱ色谱柱(4.6 mm×250 mm，5μm)，流动相A为乙腈，流动相B为(0.1%磷酸+2%四氢呋喃水溶液)，检测波长248 nm，流速0.8 ml/min，柱温35 ℃，进样20 μl。其梯度洗脱程序为：0～18 min，流动相B由90%→85%；>18～20 min，流动相B保持85%；>20～23 min，流动相B由85%→77%；>23～50 min，流动相B保持77%；>50～55 min，流动相B由77%→90%。

2.4 方法学考察

2.4.1 系统适应性：取对照品溶液按测定方法进样，丹酚酸B的理论塔板数在40 000以上。

2.4.2 精密度试验：取同一批供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件连续进样6次，测定高效液相色谱图。结果表明，各共有峰相对保留时间的RSD为0.03%～0.77%，相对峰面积的RSD为0.11%～0.36%。

2.4.3 稳定性试验：取同一批供试品溶液，分别于配制后0、2、4、6、8、24 h进样分析，测定高效液相色谱图。结果表明，各共有峰相对保留时间的RSD为0.08%～0.82%，相对峰面积的RSD为0.09%～0.51%。

2.4.4 重复性试验：取同一批供试品药材饮片，按“2.1”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件测定高效液相色谱图。结果表明，各共有峰的相对保留时间的RSD为0.02%～0.72%，相对峰面积的RSD为0.09%～0.37%。

2.5 样品测定

取10批利胆排毒方提取物供试品，按照“2.3”项下的条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，见图1—3。图1为混合对照品的高效液相色谱图，图2为利胆排毒方提取物的对照指纹图谱，图3为10批次利胆排毒方的高效液相色谱叠加图。

图2 利胆排毒方提取物的对照指纹图谱Fig 2 Reference fingerprint of extraction of Lidanpaidu prescriptions

图3 10批次利胆排毒方提取物的高效液相色谱叠加图Fig 3 HPLC overlay chart of 10 batches of extraction of Lidanpaidu prescriptions

2.6 指纹图谱的建立

2.6.1 参照物的选择：高效液相色谱图中38.9 min时色谱峰的峰面积适中且稳定，经与对照品鉴定为丹酚酸B，故选为参照峰(即图2中16号峰)。

2.6.2 指纹图谱的建立与相似度评价：采用国家药典委员会《中药指纹图谱相似度评价系统》(2004 A版)，评价10批次利胆排毒方提取物的高效液相色谱图，确定了19个共有峰(见图2)，建立了利胆排毒方提取物指纹图谱的共有模式。取利胆排毒方单位药材饮片提取样品，按照相同的高效液相色谱条件分析确定峰的来源[14]。通过对照，确定1、4号峰来源于栀子，2、5、9、11、12、13号峰来源于金银花，3号峰来源于金银花、栀子、茵陈，6、10号峰来源于黄芪，7号峰来源于连翘，8、14、15、16、17号峰来源于丹参，18、19号峰来源于大黄，炙甘草对共有峰没有贡献。以丹酚酸B为参照峰，其保留时间和峰面积均为1.000，计算其他各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示，10批次样品的相似度分别为0.983、0.993、0.993、0.985、0.984、0.995、0.997、0.990、0.992、0.994，各批次的相似度都在0.98以上，见表1—2。

3 讨论

3.1 色谱柱的考察

本实验考察了WelchromTM色谱柱、Waters Cosmosil 5C-18-MS-Ⅱ色谱柱。结果显示，Waters Cosmosil 5C-18-MS-Ⅱ色谱柱基线较平稳，出峰较多且分离度较好，故选择Waters Cosmosil 5C-18-MS-Ⅱ色谱柱。

3.2 检测波长的考察

本实验对已知对照品与利胆排毒方提取物进行波长扫描，选取230、248、254、290、360 nm 5个波长，分别对利胆排毒方提取物进行分析。结果显示，230 nm下虽然出峰较多，但基线漂移较为严重；254 nm下分离度较差；290与360 nm下色谱峰较少；而在248 nm下，色谱峰较多，用于对照的3个标准品分离度适中，基线比较平稳，故选择248 nm为最佳检测波长。

3.3 流动相的考察

本实验考察了甲醇-磷酸水溶液、乙腈-磷酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸+2%四氢呋喃水溶液3种流动相系统。结果显示，乙腈-0.1%磷酸+2%四氢呋喃水溶液系统基线最为平稳，各峰分离度较好，适合高效液相色谱分析，所以最终选择以乙腈-0.1%磷酸+2%四氢呋喃水溶液为流动相。

表1 10批次利胆排毒方提取物特征图谱共有峰的相对保留时间

表2 10批次利胆排毒方提取物特征图谱共有峰的相对峰面积

3.4 指纹图谱的建立

对10批次利胆排毒方提取物进行相似度分析，结果显示，其指纹图谱之间吻合度较高，相对保留时间的RSD均<0.6%，而相对峰面积的RSD却达到了36.69%，这客观显示了中药复方制剂这一传统剂型的缺陷，有效成分因为产地、炮制以及煎煮方法和优化条件的无法量化而差异较大，因此，中药复方新剂型的开发及其质量标准的建立是目前应该思考和解决的问题[15]。虽然有些成分峰表面看上去不明显，或者部分峰难以分离，但通过高效液相检测器检测出各成分间的相对比例较为相似，整体轮廓均符合共有模式，对相似度影响不大，以共有模式作为利胆排毒方制剂质量控制研究的参考依据还是有可行性的，能够确保产品的相对一致。

3.5 展望

中药复方的物质基础研究比较困难，但指纹图谱可以较为全面和综合地控制其内在质量，可为复方药效学、毒理学研究、制剂工艺及质量标准研究提供参考。利胆排毒方提取物指纹图谱的建立，有望为其新制剂、新剂型的研究开发提供参考。

[1]湖北中医学院.一种抗内毒素血症的中药组合物及其制备方法：中国，CN101066309A[P].2007-11-07.

[2]常明向.利胆排毒口服液抗内毒素的作用研究[D].武汉：湖北中医药大学，2007.

[3]曹艳，崔瑞勤，陈科力，等.利胆排毒口服液不同极性部位体外抗内毒素作用研究[J].湖北中医药大学学报，2015，17(2)：48-50.

[4]白瑞，王真真.指纹图谱在中药质量控制中的应用进展[J].安徽医药，2009，13(12)：1458-1462.

[5]李昕，王月茹，马利，等.中药色谱指纹图谱在中药质量评价中的应用[J].生物医学工程学杂志，2012，29(1)：192-196.

[6]易伦朝，吴海，梁逸曾.色谱指纹图谱与中药质量控制[J].色谱，2008，26(2)：166-171.

[7]孙磊，乔善义，赵毅民.中药指纹图谱应用研究进展[J].国际药学研究杂志，2009，36(3)：194-197，203.

[8]王其田，杨西晓，郭丹.小承气汤的高效液相色谱指纹图谱研究[J].中国药业，2007，16(20)：28-29.

[9]毛秀红，张彤，刘云，等.不同工艺的茵栀黄注射液的指纹图谱研究[J].中国医药工业杂志，2009，40(6)：417-420.

[10] 何瑶，傅舒，傅超美，等.四物汤不同提取工艺HPLC指纹图谱研究[J].成都大学学报：自然科学版，2011，30(4)：294-297.

[11] 黄良永，郑江萍，杜士明.金茵清热口服液HPLC指纹图谱研究[J].中国药师，2014，17(1)：71-74.

[12] 程茜菲，刘银环，许苗苗，等.丹参饮片HPLC指纹图谱研究[J].西北药学杂志，2013，28(6)：556-558.

[13] 张珺，程月发.丹参制剂高效液相色谱指纹图谱研究现状[J].药学研究，2014，33(6)：348-351，356.

[14] 刘宏明，徐楠楠，聂磊.指纹图谱分析结合多指标成分定量用于六味五灵片的质量评价[J].中国中药杂志， 2014，39(10)：1816-1821.

[15] 徐寅生，耿耘，涂显琴，等.大承气汤水煎剂HPLC指纹图谱研究[J].中国药科大学学报，2010，41(6)：535-538.

Study on Fingerprint of Lidanpaidu Prescription by HPLCΔ

ZHANG Fan, CUI Ruiqin, HUANG Bisheng, LI Juan, CHEN Keli, CAO Yan

(College of Pharmacy, Hubei University of Chinese Medicine,Hubei Wuhan 430065, China)

OBJECTIVE：To probe into the fingerprint of Lidanpaidu prescription, and provide basis for the material foundation and quality control of Lidanpaidu prescription. METHODS: Waters Cosmosil 5C18-MS-Ⅱ chromatographic column(4.6 mm×250 mm，5 μm)was adopted with the mobile phase of acetonitrile(B)-0.1% phosphate and 2% tetrahydrofuran aqueous solution(A) by gradient elution at flow rate of 0.8 ml/min, detection wavelength of 248 nm and column temperature of 35 ℃. Analysis was conducted on 10 batches of Lidanpaidu extraction by correlation coefficient method. RESULTS: The HPLC fingerprint of Lidanpaidu prescription was established, 19 common peaks were signed, and the similarity threshold of 10 batches of samples were between 0.984-0.997. CONCLUSIONS: The established method is accurate and reliable, and can be used for the study on the chemical material foundation of the formula and the evidence for quality control of Lidanpaidu prescription.

Lidanpaidu prescription; Fingerprint; HPLC

�对照品的高效液相色谱图 Fig 1 HPLC of mixed

ubstance

湖北省教育厅中青年人才项目资助(No.Q20121610)

R927.11

A

1672-2124(2016)10-1314-04

2016-05-22)

*在读硕士研究生。研究方向：中药制剂新剂型新技术的研究。E-mail：249255521@qq.com

#通信作者：博士，副教授。研究方向：中药制剂新剂型新技术的研究。E-mail：caoyan7593@163.com

DOI 10.14009/j.issn.1672-2124.2016.10.006