人巨细胞病毒感染在颅咽管瘤中的表达及意义

闫志丰 李三中 董秋峰 陈晓燕 李娟 霍军丽 高大宽 甄海宁 费舟(第四军医大学西京医院神经外科, 陕西 西安 710032)

人巨细胞病毒感染在颅咽管瘤中的表达及意义

闫志丰 李三中 董秋峰 陈晓燕 李娟 霍军丽 高大宽 甄海宁*费舟*
(第四军医大学西京医院神经外科, 陕西 西安 710032)

目的检测人巨细胞病毒(HCMV)感染在颅咽管瘤组织中的表达，探讨HCMV感染与颅咽管瘤发生的病因学关系。方法采用免疫组化方法检测HCMV立刻早期蛋白1-72(IE1-72)和磷酸化糖蛋白65(pp65)抗原在89例颅咽管瘤组织及10例正常脑组织中的表达情况。结果在颅咽管瘤组织中HCMV IE1-72和pp65抗原表达阳性率分别为77.5%和84.3%，而在正常脑组织中两抗原均为阴性，IE1-72和pp65抗原表达阳性率在颅咽管瘤组织和正常脑组织间均有显著性差异(P=0.000，P=0.000)。IE1-72抗原在牙釉质型和鳞状乳头型颅咽管瘤组织中阳性率分别为83.6%和67.6%，pp65抗原分别为89.1%和76.5%；两抗原在牙釉质型颅咽管瘤组织中的阳性率均略高于鳞状乳头型，但均无统计学差异(P=0.135，P=0.197)。结论HCMV IE1-72和pp65抗原在颅咽管瘤组织中均有高表达，而在正常脑组织中无表达，HCMV感染及其抗原表达可能与颅咽管瘤的发生有一定关系，其致病机制尚需进一步研究。

人巨细胞病毒; 颅咽管瘤; 免疫组化; 立刻早期蛋白1-72; 磷酸化糖蛋白65

人巨细胞病毒(human cytomegalovirus, HCMV)是最大的β疱疹病毒，在人群中普遍感染，其可通过垂直和水平途径进行传播。近年来资料显示HCMV在胶质瘤、乳腺癌、前列腺癌和结直肠癌等人类多种类型肿瘤中都有较高的感染率和抗原表达阳性率[1～4]，提示HCMV可能是导致人类某些类型肿瘤形成和发展的一个重要病因。颅咽管瘤是儿童和青少年常见的颅内先天性肿瘤，约占颅内肿瘤的4%。目前对于颅咽管瘤的发病机制尚不完全清楚，HCMV感染是否与其发生有关，国内外尚未见研究报道。本文采用免疫组化方法检测了HCMV立刻早期蛋白1-72(immediate early protein 1-72, IE1-72)和磷酸化糖蛋白65(phosphorylated glycoprotein 65, pp65)两种抗原在颅咽管瘤组织中的表达情况，旨在探讨HCMV感染及其抗原表达与颅咽管瘤发生可能存在的病因学关系。

材料与方法

一、组织标本

连续收取2006年6月至2010年12月西京医院神经外科手术切除且经病理组织学检查确诊的颅咽管瘤组织89例，其中男49例、女40例(男女比例为1 ∶0.82)，平均年龄31.69岁；牙釉质型颅咽管瘤55例、鳞状乳头型34例。另收取10例来自高血压脑出血手术皮层造瘘获到的正常人脑组织。所有标本经10%福尔马林固定，石蜡包埋，蜡块连续切片，厚4 μm，贴于涂有3-氨丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxy silane, APES)防脱片胶的载玻片，置于58℃ 6 h烤片后备用。

二、免疫组化

1.试剂：HCMV IE1-72和pp65单克隆抗体分别购自美国的Millipore公司和英国的Leica公司。EnVision试剂盒购自丹麦的DAKO公司。

2.染色步骤：采用聚合物-过氧化物酶(polymer-peroxidase, PP)免疫组化两步法。石蜡切片常规脱蜡水化，蒸馏水冲洗后置于乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)缓冲液(pH 9.0)中高压热修复2 min 15 sec，自然冷却至室温。取出玻片，蒸馏水冲洗后用磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution, PBS)振洗3次，每次5 min。用3% H2O2于室温下孵育10 min，以封闭内源性过氧化物酶活性。用动物血清工作液于室温下孵育1 h，以封闭非特异性结合位点。去除血清滴加一抗(IE1-72和pp65抗体分别按1 ∶100和1 ∶50稀释)，4℃冰箱孵育过夜。PBS振洗3次，每次5 min，滴加EnVision复合物液，于室温下孵育40 min。二氨基联苯胺(diaminobenzidine, DAB)显色，苏木素复染，常规脱水、透明、中性树胶封片。以高表达HCMV IE1-72和pp65的直肠癌组织作为阳性对照(图1, 2)，以PBS代替一抗作为阴性对照(图7)。

三、结果判定

HCMV IE1-72和pp65抗原免疫组化阳性为胞浆和(或)胞核呈棕黄色染色，在×400高倍视野下观察，每例组织切片随机选取5个视野，使用目镜网格测微尺计数细胞。

四、统计学分析

采用SPSS 17.0软件包进行统计学分析，抗原阳性率在颅咽管瘤与正常脑组织之间、不同病理类型之间以及患者性别之间的比较采用χ2检验，抗原表达与患者年龄之间的关系采用Spearman等级相关分析，P<0.05定为差异有统计学意义。

结 果

一、HCMV抗原在颅咽管瘤和正常人脑组织中的表达

HCMV IE1-72和pp65抗原在颅咽管瘤胞浆和胞核中都有着色，阳性细胞在肿瘤组织上皮细胞中分布不均匀(图3～6)。颅咽管瘤组织中HCMV IE1-72和pp65抗原阳性率分别为77.5%和84.3%，而正常人脑组织全为阴性(图8)。HCMV IE1-72和pp65抗原表达阳性率在颅咽管瘤组织和正常人脑组织之间均有显著性差异(χ2=22.045，P=0.000；χ2=30.324，P=0.000)。

二、HCMV抗原表达与颅咽管瘤临床病理学特征的关系

HCMV IE1-72在牙釉质型(图3)和鳞状乳头型(图4)颅咽管瘤组织中阳性率分别为83.6%和67.6%，pp65在牙釉质型(图5)和鳞状乳头型(图6)颅咽管瘤组织中阳性率分别为89.1%和76.5%；两抗原在牙釉质型颅咽管瘤组织中的阳性率均略高于鳞状乳头型，但均无显著性差异(χ2=2.234，P=0.135；χ2=1.662，P=0.197)。IE1-72和pp65两抗原阳性率在男女性别间均无显著性差异(χ2=0.595，P=0.440；χ2=0.215，P=0.643)，IE1-72和pp65两抗原表达与患者年龄亦无明显相关性(r=0.009，P=0.930；r=0.056，P=0.599)。

图1 HCMV IE1-72在阳性对照直肠癌组织中强表达(DAB, ×400)

Fig 1 Strong expression of HCMV IE1-72 in positive control rectal cancer tissue (DAB, ×400)

图2 HCMV pp65在阳性对照直肠癌组织中强表达(DAB, ×200)

Fig 2 Strong expression of HCMV pp65 in positive control rectal cancer tissue (DAB, ×200)

图3 HCMV IE1-72在牙釉质型颅咽管瘤中呈阳性表达(DAB, ×400)

Fig 3 Positive expression of HCMV IE1-72 in adamantinomatous type craniopharyngioma (DAB, ×400)

图4 HCMV IE1-72在鳞状乳头型颅咽管瘤中呈阳性表达(DAB，×400)

Fig 4 Positive expression of IE1-72 in papillary type craniopharyngioma (DAB, ×400)

图5 HCMV pp65在牙釉质型颅咽管瘤中呈阳性表达(DAB，×400)

Fig 5 Positive expression of HCMV pp65 in adamantinomatous type craniopharyngioma (DAB, ×400)

图6 HCMV pp65在鳞状乳头型颅咽管瘤中呈阳性表达(DAB，×400)

Fig 6 Positive expression of HCMV pp65 in papillary type craniopharyngioma (DAB, ×400)

图7 颅咽管瘤阴性对照(DAB，×400)

Fig 7 Negative control of craniopharyngioma (DAB, ×400)

图8 HCMV抗原在正常脑组织中无表达(DAB，×400)

Fig 8 No expression of HCMV antigens in normal brain tissue (DAB, ×400)

讨 论

HCMV是最大的β疱疹病毒，具有种属特异性，在人群中的感染率高达60%～90%，女性感染率显著高于男性，其可通过垂直和水平途径进行传播[5]。人被HCMV感染后一般无明显症状，形成潜在感染，当免疫功能降低时能再次激活，可导致人多种器官的严重炎症反应，甚至致死[6,7]。最近有学者发现HCMV感染存在于人类多种类型肿瘤组织中，并与肿瘤的恶性程度有正相关性。Cobbs等在WHO Ⅱ～Ⅳ级胶质瘤组织中采用免疫组化方法检测HCMV IE1-72和pp65抗原，结果显示二者表达阳性率均为100%，而在正常人脑组织中二者表达均为阴性[8]。Harkins等在结直肠癌和肠息肉组织中检测IE1-72和pp65抗原，结果结直肠癌组织中两抗原阳性率分别为80%和92%，肠息肉组织分别为82%和78%[4]；该作者也在乳腺癌上皮组织中检测了HCMV多种抗原的表达，其中IE1-72阳性率为93%，正常乳腺上皮组织阳性率为63%，IE1-72阳性率在乳腺癌上皮组织和正常乳腺上皮组织中存在显著差异[2]。在动物实验中，Cobbs等发现感染鼠巨细胞病毒后鼠脑胶质细胞染色质呈纺锤体形状，增生活跃[9]，且小鼠的生存率明显降低；最新的临床对照试验也显示HCMV感染能降低胶质瘤患者预后生存率[10]。以上结果提示HCMV长期感染可能与人某些赘生物及肿瘤的发生和发展甚至预后有关，但不同类型肿瘤间HCMV感染和抗原表达阳性率有所不同，提示HCMV感染和抗原表达可能与肿瘤的生长部位和组织类型有关。

颅咽管瘤是儿童和青少年常见的颅内先天性肿瘤，约占颅内肿瘤的4%。颅咽管瘤临床表现通常复杂而严重，治疗很棘手，手术往往难以彻底切除，放化疗效果有限，肿瘤复发率高[11]，预后差[12]。目前有关颅咽管瘤的病因学和发病机制尚不完全清楚，这也是临床上缺乏有效防治方法的一个重要因素。HCMV感染是否与颅咽管瘤的发生有关，国内外尚未见有关研究报道。本研究采用免疫组化方法检测HCMV IE1-72和pp65抗原在89例颅咽管瘤组织中的表达，结果显示IE1-72和pp65两抗原在颅咽管瘤组织中均有较高表达，而二者在10例正常人脑组织中均无表达，HCMV IE1-72和pp65抗原阳性率均显著高于正常脑组织，提示HCMV感染及抗原表达可能与颅咽管瘤的发生有一定关系，HCMV可能是颅咽管瘤发生的一个重要病因。已知HCMV可通过垂直传播途径由母体感染胎儿，在胎儿神经系统发育过程中HCMV有可能导致胎儿颅颊囊前壁的颅咽管鳞状上皮细胞退化不完全，并促进其生长和变异，从而逐渐形成颅咽管瘤。在颅咽管瘤两病理分型间，IE1-72和pp65抗原在牙釉质型中阳性率均略高于鳞状乳头型，但无统计学显著性差异，这可能与本组样本量较小有关，但仍提示HCMV感染可能与颅咽管瘤的不同病理组织类型发生有关。本组IE1-72和pp65抗原表达阳性率在男女性别间无显著差异，二者表达与患者年龄也无明显相关性，提示不同性别和不同年龄的颅咽管瘤患者有着相似的HCMV感染率。

研究表明HCMV感染后其短独特序列(short unique, US)US2、US3、US6、US11和长独特序列(long unique, UL)UL111基因编码的相应蛋白，能减少Ⅰ类主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)的表达，并竞争性结合自然杀伤细胞(natural killer cell, NK)的免疫球蛋白样转录体受体(leukocyte Ig-like receptor 1/ Ig-like transcript 2, LIR1/ILT2)，保护已感染细胞免于NK细胞的杀伤作用；UL111A能降低树突状细胞识别、吞噬和呈递抗原及激活T细胞的作用，显著地抑制机体的细胞-体液免疫；UL112可通过下调NK细胞膜上MHCⅠ类相关分子B的表达，抑制活化型受体(natural-killer group2 member D, NKG2D)及其配体的表达和识别功能，进而抑制NK细胞的免疫功能[13]，形成免疫逃避机制和持续感染。

最新研究结果认为HCMV持续感染可能促进肿瘤的发生发展。Michaelis等研究认为HCMV IE1和IE2抗原能抑制或阻断腺病毒E1A蛋白和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor, TNF-α)诱导的细胞凋亡及Fas介导的凋亡，促进肿瘤的发生发展[14]。而且HCMV感染能降低黏附因子CD56的表达量并激活整合素β1α5，使肿瘤细胞间和肿瘤细胞与内皮细胞间的黏附性降低及内皮细胞破裂死亡，促进肿瘤细胞的侵袭和迁移[15]。HCMV感染血管内皮细胞后IE1蛋白和UL28联合作用通过结合整合素β1和β3及表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor, EGFR)上调血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)受体的表达，调节核转录因子(nuclear factor-κB, NF-κB)和活化蛋白(activator protein-1, AP-1)诱导白细胞介素-8(interleukin-8, IL-8)表达，促进微血管生成，并改变微血管表型[16]，增加血管壁的通透性并造成血管壁损伤，利于肿瘤细胞的穿透和黏附。

总之，本研究证实HCMV抗原在颅咽管瘤组织中有较高的表达阳性率，而在正常脑组织中无表达，提示HCMV感染可能与人颅咽管瘤的发生有一定关系，但其确切机制尚需进一步研究。

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Infectionandexpressionofhumancytomegalovirusincraniopharyngiomasanditssignificance

YANZhifeng,LISanzhong,DONGQiufeng,CHENXiaoyan,LIJuan,HUOJunli,GAODakuan,ZHENHaining,FEIZhou

DepartmentofNeurosurgery,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi'an710032, China

ObjectiveThe infection and expression of human cytomegalovirus (HCMV) in craniopharyngioma tissues are detected to investigate the etiological relation between HCMV infection and craniopharyngioma formation.MethodsExpressions of immediate early protein 1-72 (IE1-72) and phosphorylated glycoprotein 65 (pp65) antigens of HCMV were examined by immunohistochemistry method in 89 cases of craniopharyngioma and 10 cases of normal brain tissues.ResultsThe positive rates of HCMV IE1-72 and pp65 expression were 77.5% and 84.3% in craniopharyngiomas, respectively, but not in normal brain tissues; there were significant differences in the positive expression rates of HCMV IE1-72 and pp65 antigen between craniopharyngiomas and normal brain tissues (P=0.000,P=0.000). The positive rates of IE1-72 in adamantinomatous type and papillary type of craniopharyngiomas were 83.6% and 67.6% respectively, while that of pp65 was 89.1% and 76.5%, respectively; although positive expression rates of IE1-72 and pp65 in adamantinomatous type were a little higher than that in papillary type, there was no significant difference for both two groups (P=0.135,P=0.197).ConclusionBoth HCMV IE1-72 and pp65 are highly expressed in craniopharyngiomas, while no expression of them is found in normal brain tissues, which implies HCMV infection and expression may be associated with craniopharyngioma formation, and the related pathogenic mechanism need research further.

Human cytomegalovirus (HCMV); Craniopharyngioma; Immunohistochemistry; Immediate early protein 1-72 (IE1-72); Phosphorylated glycoprotein 65 (pp65)

1671-2897(2016)15-148-04

·论著·

R 446.5

A

第四军医大学西京医院学科助推计划创新人才基金资助项目(XJZT08R09)

闫志丰，硕士研究生，E-mail：yanzf515@163.com

*通讯作者： 甄海宁，副教授、副主任医师，E-mail：zhenhn@fmmu.edu.cn；费舟，教授、主任医师，博士生导师，E-mail: feizhou@fmmu.edu.cn

2012-10-24；

2012-12-17)