高效液相色谱法同时测定百华花楸果实中金丝桃苷和芦丁的含量

2016-11-19孟令锴张朝立高长久等

中国医药导报 2016年4期

孟令锴张朝立高长久等

[摘要] 目的建立同時测定百华花楸果实中金丝桃苷和芦丁含量的高效液相色谱分析方法。方法采用高效液相色谱法，色谱柱为Zorbax SB-C18柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），流动相为甲醇∶乙腈∶0.025 mol/L磷酸（10∶20∶70），流速1.0 mL/min，检测波长363 nm，柱温30℃。结果金丝桃苷和芦丁分别在0.1～0.8 μg和0.16～1.28 μg范围内，进样量与色谱峰面积呈良好线性关系，相关系数分别为0.9994和0.9992；平均回收率（n = 9）分别为98.58%和98.22%，RSD分别为1.71%和1.81%；平均含量分别为0.473、0.342 mg/g。结论该法操作简便、准确，稳定性及重复性好，可用于对百华花楸果实中金丝桃苷和芦丁成分的含量测定。

[关键词] 百华花楸；金丝桃苷；芦丁；高效液相色谱法

[中图分类号] R927.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）02（a）-0032-05

HPLC determination of content of hyperoside and rutin in fruit of Srobus pohuashanensis

MENG Lingkai1 ZHANG Chaoli1 GAO Changjiu1 LI Jie2

1.Natural Medicinal Chemistry and Pharmacognosy Teaching and Research Section， Mudanjiang Medical College， Heilongjiang Province， Mudanjiang 157011， China； 2.Department of Hematology， the Affiliated Hongqi Hospital of Mudanjiang Medical College， Heilongjiang Province， Mudanjiang 157011， China

[Abstract] Objective To establish HPLC method for the determination of hyperoside and rutin in fruit of Srobus pohuashanensis. Methods The Zorbax SB-C18 （5 μm， 4.6 mm×250 mm） column was adopted and eluted with mobile phase consisted of methanol∶acetonitrile∶0.025 mol/L aqueous phosphoic acid （10∶20∶70） at the column temperature of 30℃. The flow rate was 1.0 mL/min and detective wave length was 363 nm. Results Hyperoside was proved to be linear in the range of 0.16-1.28 μg with a regression coefficient of 0.9992， the average recovery was 98.22% with RSD of 1.71%； Rutin was proved to be linear in the range of 0.1-0.8 μg with a regression coefficient of 0.9994， the average recovery was 98.58% with RSD of 1.81%. The average content of hyperoside and rutin was 0.473 mg/g and 0.473 mg/g respectively. Conclusion The developed method is convenient and accurate with high repeatability and stability， which is suitable for the content determination.

[Key words] Srobus pohuashanensis； Hyperoside； Rutin； HPLC method

百华花楸（Srobus pohuashanensis）为蔷薇科（Ros-aceae）花楸属（Sorbus）植物，其果实称“花楸果” [1]。蔷薇科（Rosaceae）花楸属（Sorbus）在全世界有80余种，广产于热带及亚热带地区，尤其在北半球，系为分布广阔的大属植物。我国有50余种，分布于东北、西北和东南等地区。该属植物民间很早就入药，药用的花楸主要有西伯利亚花楸（S.aucu Paria）、百华花楸（S.pohuashanensis）、天山花楸（S.tianshanie）及变种天山毛花楸（S.tianshaniea.var.tomentosa）等[2]。研究表明，花楸属植物中含有较丰富的黄酮、花青素、类山梨酸苷、生氰苷等成分，具有抗氧化、抗癌、抗辐射、降糖、保护心肌缺血和止咳平喘等药理作用[2-5]。花楸属植物的果实也具有较高的药用价值，研究证实其主要的活性成分为黄酮类化合物，主要为金丝桃苷、芦丁等活性物质[6-8]。百华花楸产自我国黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古等地区。民间常以果实、嫩枝叶及茎皮入药。其果实味苦甘、性平；嫩枝叶及茎皮味苦、无毒，具有清热利肺、补脾生津之功效[9]。百华花楸在黑龙江省资源丰富，但相关研究却相对滞后，关于百华花楸的报道多集中在育苗、扦插繁殖等方面。对于其化学成分及药理作用鲜有报道。近年来，本课题组对百华花楸果实进行了系统研究，已初步探明了其抗炎、镇咳、平喘等药效物质基础及作用机制[10-12]。为了进一步合理开发利用该植物药材资源，控制其内在质量，本课题组以金丝桃苷和芦丁作为指标成分，采用高效液相色谱法同时测定其在百华花楸果实中的含量，以便建立一种简便易行，结果准确可靠的金丝桃苷和芦丁的测定方法，为该药材药用资源的系列开发提供参考资料。

1 仪器与试药

Agilent 1100高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；KQ5200超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；甲醇、乙腈为色谱纯，水为重蒸水；金丝桃苷对照品（购于中国药品生物制品检定所，批号：111521-200303），芦丁对照品（购于中国药品生物制品检定所，批号：100080-200306），其余试剂均为分析纯。

百华花楸果实采自黑龙江省牡丹江地区，经牡丹江医学院天然药物化学与生药学教研室吴兆华教授鉴定为蔷薇科（Rosaceae）花楸属（Sorbus）百华花楸（Srobus pohuashanensis）干燥成熟的果实。

2 方法与结果

2.1 检测波长的确定

取适当浓度的金丝桃苷与芦丁混合对照品溶液进行紫外扫描，在200～600 nm波长下，金丝桃苷与芦丁在363 nm波长处有较强吸收，并且两峰分离效果较好，故选定检测波长为363 nm。

2.2 色谱条件的确定

色谱柱：Zorbax SB-C18柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），流动相：甲醇︰乙腈︰0.025 mol/L磷酸（10∶20∶70），流速为1.0 mL/min，检测波长为363 nm，柱温为30℃。在本色谱条件下，百华花楸果实中芦丁和金丝桃苷的色谱峰与其他成分相邻的色谱峰能够达到很好的分离，理论塔板数按金丝桃苷和芦丁色谱峰计算均不低于5000。结果见图1。

2.3 样品中金丝桃苷和芦丁提取方法的考察

称取百华花楸果实药材9份，每份5 g，以甲醇超声提取，选取溶剂用量（A）、提取时间（B）和提取次数（C）为考察因素，每个因素选取3个水平，因素水平表见表1，选用L9（34）正交试验表安排实验，以金丝桃苷提取率为考察指标，将结果填入正交试验表中，进行直观分析和方差分析[13-15]。由表2、4可知，RC>RA>RB，表明提取率的影响从大到小分别为：提取次数>溶剂用量>提取时间；以芦丁提取率为考察指标，将结果填入正交试验表中，进行直观分析和方差分析。由表3、5可知，RC>RA>RB，表明提取率的影响从大到小分别为：提取次数>溶剂用量>提取时间；通过以上实验结果，结合直观分析、方差分析及实际实验情况，最终确定实验方案为：20倍提取溶剂，超声提取3次，每次30 min。

表1 因素水平表

表2 金丝桃苷提取优化正交试验结果

表3 芦丁提取优化正交试验结果

表4 金丝桃苷含量为指标方差分析

注：*表示显著性

2.4 溶液的制备

2.4.1 对照品溶液的制备精密称取4.0 mg金丝桃苷对照品，置于25 mL容量瓶中，加入少量甲醇超声溶解并稀释定容至刻度，制成160 μg/mL的金丝桃苷对照品储备液；另精密称取2.5 mg芦丁对照品，置于25 mL容量瓶中，加入少量甲醇超声溶解并稀释定容至刻度，制成100 μg/mL的芦丁对照品储备液；分别精密吸取2 mL芦丁对照品储备液和2 mL金丝桃苷对照品储备液置于10 mL容量瓶中，摇均，甲醇定容至刻度，制成含20 μg/mL芦丁对照品和32 μg/mL金丝桃苷对照品的混合对照品储备液。

2.4.2 样品溶液的制备称取百华花楸果实药材5 g，置于100 mL容量瓶中，加适量甲醇，超声提取3次，每次30 min，再加甲醇定容至刻度，离心，取上清液经0.45 μm的微孔滤膜过滤，即得。

2.5 线性关系考察

精密吸取金丝桃苷对照品储备液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL于10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，按“2.2”项下条件，进样10 μL，测定峰面积，以峰面积值为纵坐标，对照品量（μg）为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程为：Y=4.08×104X +6.68×103，r = 0.9992，結果表明金丝桃苷在0.16～1.28 μg的范围内呈良好线性关系；另精密吸取芦丁对照品储备液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL于10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，按“2.2”项下条件，进样10 μL，测定峰面积，以峰面积值为纵坐标，对照品量（μg）为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程Y=3.87×104X+5.79×103，r = 0.9994，结果表明芦丁在0.1～0.8 μg的范围内呈良好线性关系。

2.6 精密度试验

精密吸取金丝桃苷和芦丁混合对照品储备液，按“2.2”项下条件，重复进样6次，每次进样量10 μL，记录峰面积，计算日内精密度；连续进样3 d，计算日间精密度。结果表明，日内精密度：金丝桃苷峰面积值的RSD=0.58%，芦丁的RSD=0.76%；日间精密度：金丝桃苷峰面积值的RSD=0.77%，芦丁的RSD=0.87%。以上结果表明仪器精密度较好。

2.7 稳定性试验

取同一份供试品溶液，按“2.2”项下条件，分别于0、1、2、4、8 h分别进样测定，记录金丝桃苷、芦丁组分峰面积。结果金丝桃苷峰面积值的RSD=0.79%；芦丁峰面积值的RSD=0.92%，表明金丝桃苷、芦丁组分在8 h内稳定。

2.8 重复性试验

取百华花楸果实药材5 g，按“2.4.2”项下样品溶液的制备方法进行，平行制备供试液6份，按“2.2”项下条件测定含量，药材中金丝桃苷和芦丁的平均含量分别为0.47、0.34 mg/g。RSD分别为1.18%、1.59%。表明方法重复性较好。

2.9 回收率试验

精密称取已测知含量的百华花楸果实药材5 g，按照“2.4.2”项下样品制备方法制备供试品溶液，吸取供试品溶液2、4、6 mL各3份，分别置于10 mL容量瓶中，再精密加入高、中、低浓度的金丝桃苷和芦丁对照品溶液，加甲醇定容至刻度，按“2.2”项下色谱条件进行进样测定，结果见表6、7。结果金丝桃苷回收率的RSD与芦丁回收率的RSD均小于2%，表明该方法准确度较高。

表6 金丝桃苷回收率测定结果（n = 9）

表7 芦丁回收率测定结果（n = 9）

2.10 样品测定

取百华花楸果实药材样品6份，精密称定，置100 mL量瓶中加甲醇适量，超声提取3次，每次30 min，放冷，用甲醇稀释至刻度，摇均，过滤，取滤液再经0.45 μm的微孔滤膜滤过，即得。精密吸取供试品溶液10 μL，注入高效液相色谱仪，按“2.2”项下条件测定，记录色谱峰面积，采用标准曲线记录含量。结果样品中金丝桃苷与芦丁的平均含量分别为0.473、0.342 mg/g；RSD分别为1.29%、1.28%。结果见表8。

表8 含量测定结果（n = 6）

1.芦丁 2.金丝桃苷

图1 混合对照品（A）与样品溶液（B）高效液相色谱图

3 讨论

黑龙江省花楸属植物资源较为丰富，花楸属植物果实具有较高的药用价值，其主要的活性成分为黄酮类化合物，主要为金丝桃苷、芦丁等活性物质，具有解痉、镇咳、抗炎、抗病毒等作用。目前，对黑龙江省百华花楸果实相关研究较匮乏，尚未见有同时测定百华花楸果实中金丝桃苷、芦丁两组分的文献报道。本研究采用高效液相色谱法同时测定金丝桃苷和芦丁的含量，方法简便易行，结果准确、可靠。可作为百华花楸果实中金丝桃苷和芦丁的含量测定方法。

本实验对百华花楸果实中金丝桃苷和芦丁成分的提取条件进行了优化，分别对提取溶剂用量（10、15、20倍）、提取时间（30、50、70 min）、提取次数（1、2、3次）进行正交试验，最终确定20倍的甲醇为提取溶剂，超声提取3次，每次30 min作为最佳提取工艺，该条件下金丝桃苷和芦丁提取率较高，且方法简单，经济实用；在进行金丝桃苷色谱条件优化试验中，依据资料记载情况[16-23]，分别对甲醇-磷酸；乙腈-水；乙腈-磷酸；甲醇-乙腈-磷酸等多种流动相进行了考察，结果发现以甲醇-磷酸为流动相条件下，金丝桃苷与芦丁色谱峰不能达到很好的分离，基线漂移严重；以乙腈-水为流动相条件下，金丝桃苷色谱峰存在拖尾现象；以乙腈-磷酸为流动相条件下，金丝桃苷色谱峰出现拖尾，且基线不稳；因此选择甲醇-乙腈-磷酸为流动相；考察了加入不同物质量的磷酸（0.01、0.025、0.05、0.075 mol/L）的实验结果，发现当加入0.025 mol/L的磷酸进行洗脱时的柱效和分离度最好，并能有效消除拖尾现象，因此最终确定以甲醇∶乙腈∶0.025 mol/L磷酸（10∶20∶70）为最佳流动相。

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