葛根素对大鼠心肌缺血再灌注损伤中Cx43的影响

姚树青，崔成立

(包头医学院，内蒙古包头 014060)



葛根素对大鼠心肌缺血再灌注损伤中Cx43的影响

姚树青，崔成立

(包头医学院，内蒙古包头 014060)

目的：探讨葛根素对大鼠心肌缺血再灌注损伤中缝隙连接蛋白43含量及分布状况的影响。方法：72只健康SD大鼠随机分成4组，每组18只，分别为空白对照组、实验对照组、葛根素预处理组及葛根素后处理组。观察各组心肌纤维的形态变化，应用免疫组化分析心肌缝隙连接蛋白43(connexin 43,Cx43)的含量及分布状况。结果：1.与空白对照组相比，实验对照组心肌纤维分布无序而紊乱，部分溶解甚至断裂，心肌细胞膜上Cx43含量显著减少(P<0.05)，分布不规律；2.与实验对照组相比，葛根素预处理组和葛根素后处理组心肌纤维分布有明显改善，细胞膜上Cx43含量明显增多(P<0.05)，且分布较规律；3.葛根素预处理组和葛根素后处理组之间无明显差异(P>0.05)。结论：葛根素对缺血再灌注损伤心肌具有一定保护作用，其机制可能与改善心肌细胞膜上Cx43的含量及分布有关。

心肌；缺血再灌注；葛根素；缝隙连接蛋白43

随着人们生活水平的提高与饮食结构的转变，冠心病的发病率及死亡率呈逐年上升趋势，心肌缺血是导致冠心病的原因之一。当心肌处于缺血状态下，通过多种手段恢复心肌血液供应，不仅不能减轻心肌损伤程度，反而会加重缺血心肌的损伤程度，即所谓的心肌缺血再灌注损伤。缝隙连接是由一种特殊的膜蛋白通道组成，主要存在于相邻心肌细胞间的闰盘处,具有亲水性和低阻抗性,是细胞间进行物质交换及信息传递的唯一途径，而心室肌缝隙连接主要以缝隙连接蛋白43(connexin 43,Cx43)为主。大量实验研究证实葛根素具有扩张冠状动脉，降低血管外周阻力，增加血流量，在一定程度上具有保护心肌的作用。本实验通过大鼠在体心肌缺血再灌注模型，观察葛根素对损伤心肌细胞膜上Cx43含量及分布的影响，初步探讨其保护机制。

1 对象与方法

1.1 主要试剂和仪器 兔抗鼠Cx43多克隆抗体(北京博奥森生物科技有限公司)；免疫组化SP试剂盒(北京博奥森生物科技有限公司)；葛根素(北京四平制药有限公司，批号:15062018)；DAB显色试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 实验对象及方法 72只健康SD大鼠(雌雄不限，体重220.2±30.0g，内蒙古大学动物实验中心提供)，随机分为4组，每组18只。葛根素预处理组：缺血前10 min经腹腔注射葛根素注射液，后缺血30 min，再灌注120 min；葛根素后处理组：缺血后10 min经腹腔注射葛根素注射液，使其共缺血30 min，再灌注120 min；实验对照组：不予药物处理，单纯缺血30 min，再灌注120 min；空白对照组：只开胸不结扎，持续麻醉状态150 min。10 %水合氯醛腹腔麻醉大鼠，仰卧位固定于手术台上，针形电极插于大鼠四肢皮下，连续监测Ⅱ导联心电图。气管插管，并接微型动物呼吸机。剪断大鼠胸骨左缘第3～4软肋，打开胸腔，剪开心包膜，用左手拇指和食指顺势将心脏挤出胸腔，于左心耳和动脉圆锥间距左心耳下缘约2 mm处穿线(6/0丝线)，进针深度约1.5 mm，结扎前在血管和结扎线之间放一软硬适度的细塑料管后再结扎，再灌注时只需将塑料管快速拔出即可。以心电图示ST段弓背抬高、结扎线以下心肌颜色变白作为心肌缺血标志；再灌注时以ST段逐渐回落，缺血区心肌颜色逐渐转暗作为再灌注标志。

1.3 观察指标

1.3.1 心肌HE染色 从每组中随机选取3只用于心肌HE染色，实验结束后取下心脏，将心脏置于甲醛中固定24 h后，用流水冲洗并修型、常规脱水、石蜡包埋、切片、二甲苯脱蜡及梯度酒精脱水、苏木素-伊红染色、梯度酒精脱水、树胶封片，光学显微镜观察。

1.3.2 心肌Cx43免疫组化 每组大鼠15只，实验完毕后取出心,4 %多聚甲醛固定24 h，流水冲洗后修型、常规脱水、石蜡包埋、切片、脱蜡至水，后按照Cx43试剂盒说明书的步骤进行实验，DAB显色(在显微镜下密切观察着色情况，染色时间不可太长)、苏木精复染、盐酸酒精分化、脱水、透明至封片，待片干后显微镜观察。每个标本取3张片子，每张切片中随机选取3个视野进行拍照观察。用Image-Pro-Plus v 7.0图像分析系统检测心肌Cx43平均光密度值(无需苏木精复染及盐酸酒精分化)。

1.4 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件进行分析，数据以均数±标准差表示。Cx43光密度多组之间比较用单因素方差分析，两组之间比较用LSD-t检验。

2 结果

2.1 HE染色 空白对照组心肌纤维排列整齐规律，无变性坏死，心肌间质无炎性细胞浸润。实验对照组心肌纤维排列紊乱，肿胀甚至部分断裂，心肌间质出现大量炎性细胞浸润。葛根素预处理组及葛根素后处理组心肌损伤的程度都较轻，心肌纤维轻度肿胀，心肌间质可见极少数炎性细胞浸润。

2.2 心肌Cx43免疫组化 空白对照组镜下可见Cx43呈棕黄色带状及点状物，大部分分布于心肌细胞端—端连接即闰盘处，少部分分布于细胞侧—侧连接处，且其走行规律，视野清晰；实验对照组Cx43走行凌乱而分散，且其分布亦发生改变，分布于闰盘处的量明显减少，而在细胞侧—侧连接处增多；葛根素预处理组和葛根素后处理组心肌细胞膜上Cx43表达量较实验对照组明显增多，且其分布情况更接近空白对照组。实验对照组Cx43光密度低于空白对照组(P<0.05)；与实验对照组相比，葛根素预处理组和葛根素后处理组Cx43光密度增高(P<0.05)；葛根素预处理组和葛根素后处理组之间Cx43光密度未见明显差异(P>0.05)详见表1，图1、图2、图3、图4。

表1 各组Cx43的免疫组化结果

a为与空白对照组比较P<0.05；b为与实验对照组比较P<0.05；c为与葛根素预处理组比较P>0.05

大量实验研究表明：心肌缺血再灌注会进一步加重心肌缺血损伤，使心功能障碍程度比急性心肌梗死更严重，病死率更高[1,2]。因此找到及时有效的应对措施和方法，是国内外研究者们的共同心愿。在心肌缺血再灌注损伤发病机制的某个环节中，可能会导致某些执行特定功能的蛋白质发生降解并表达异常，随之继发心肌细胞超微结构的改变，从而影响心肌的正常生理功能[3]。缝隙连接蛋白43起着传递心肌细胞间物质和电信号的作用，而且这种作用是其它蛋白无法取代的。心肌缺血不仅能使Cx43的表达量减少,而且还会使其分布发生改变。例如在体兔心脏的研究发现[4]，单纯缺血30 min可使左室心肌Cx43减少达40 %。当心肌发生急性梗死后Cx43表达量减少，且多散乱的分布于侧-侧连接处[5]。本实验中得到的结果亦符合以往实验结论，心肌缺血再灌注后，心肌纤维走行紊乱，部分心肌纤维断裂甚至溶解，心肌细胞膜上的Cx43含量减少，其分布发生改变且不规则。无论是缺血前给葛根素还是缺血后给葛根素，都能够使心肌纤维走行变得规律，心肌细胞膜上Cx43的含量增多，Cx43的分布变得规律。由此可说明葛根素对缺血再灌注损伤心肌具有一定的保护作用，其机制可能与改善心肌细胞膜上Cx43的含量及分布有关，但详细机制还有待进一步研究探索。

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[2] 吴锦波,吴平生,张宏斌,等.促红细胞生成素对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护性作用[J].第四军医大学学报，2009,30(19):1894-1897.

[3] 李辉，石涵，朱天民，等.红豆杉多糖对犬心肌缺血再灌注损伤模型心肌组织损伤及超微结构的影响[J].中华中医药杂志，2012，27(1)：219-223.

[4] 陈阳，胡华子，吴家驶，等.兔早期心肌缺血Connexin43的变化[J].四川大学学报(医学版)，2004,35(2)：191-193.

[5] Yao JA,Hussain W,Patel P,et al.Remodeling of gap junctional channel function in epicardial border zone of healing canine infarcts[J].Circ Res,2003,92(4):437-443.

崔成立

2016-04-05)