人白细胞抗原-G在子宫腺肌症患者子宫内膜腺细胞中通过白细胞介素-10诱导后对自然杀伤细胞的影响

王子越, 王 芳

(1.包头医学院,内蒙古包头 014060；2.包头医学院第一附属医院)



人白细胞抗原-G在子宫腺肌症患者子宫内膜腺细胞中通过白细胞介素-10诱导后对自然杀伤细胞的影响

王子越1, 王 芳2

(1.包头医学院,内蒙古包头 014060；2.包头医学院第一附属医院)

目的：从临床提取子宫腺肌症患者子宫内膜组织与同时提取的相应患者的外周血自然杀伤(natural killer，NK)细胞共培养，加入白细胞介素-10(interleukin-10，IL-10)干预，从而产生人白细胞抗原-G(human leucocyte antigen-G,HLA-G)，观察前者对NK细胞的影响。方法：首先从临床先后提取20例子宫腺肌症患者的子宫内膜组织，将组织细胞分离，弃去间质细胞，剩余的腺细胞分为A、B、C3组，同时每一组分为2个部分，即干预组和非干预组，用含有10 %胎牛血清和1%的双抗DMEM F12培养基体外培养以上3组细胞。同时干预组加入20 ng/mL的IL-10，非干预组添加等量的培养基。24 h后，A组细胞利用酶联免疫吸附试验(enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)分别测定干预组与非干预组的HLA-G的表达程度。随后应用免疫磁珠法从人外周血单个核细胞中分选出CD56+单核细胞，即NK细胞，将NK细胞与B组、C组细胞共培养，48 h后，B组用流式细胞仪检测干预组与非干预组的NK细胞凋亡率。C组用单纯计数法计数干预组与非干预组的NK细胞数量。结果：A组中，干预组HLA-G浓度平均为11.2 ng/mL，非干预组HLA-G浓度平均为3.2 ng/mL。B组中，加入IL-10的干预组与非干预组的NK细胞凋亡率分别平均为8.5 %与4.2 %。C组中，干预组与非干预组的NK细胞计数分别平均为2.5×105个/mL与1.7×105个/mL，48 h后干预组与非干预组的NK细胞计数分别平均为1.5×105个/mL与1.6×105个/mL。结论：IL-10增加了HLA-G表达，同时HLA-G的表达对NK细胞的凋亡影响并不明显，但NK细胞数量减少，说明HLA-G对NK细胞有一定的抑制作用。

人白细胞抗原-G；自然杀伤细胞；磁珠分选；流式检测；子宫腺肌症；细胞计数

人白细胞抗原-G(human leucocyte antigen-G,HLA-G)是位于人第6号染色体短臂上的一群紧密连锁基因群，具有多种结构形式，属于人类一种非经典的主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)的Ⅰ类分子，选择性高表达于侵入子宫蜕膜的绒毛外滋养细胞。近年来对HLA-G的研究越来越深入，尤其是对成人病理状态下的功能研究有着很大的进展，它在各种肿瘤组织中均有表达，其中有研究发现HLA-G的表达与肿瘤的恶性转化和免疫反应的降调相关,并且发现HLA-G具有抑制免疫细胞的功能，如T细胞、B细胞、单核-巨噬细胞以及自然杀伤(natural killer，NK)细胞，它可以促进这些免疫细胞凋亡，从而导致肿瘤细胞免疫逃避[1]。除此之外，胶质瘤表达HLA-G的膜结合的HLA-G1亚型，保护其不受同种异体T细胞和NK细胞杀伤破坏[2]；神经母细胞瘤患者血浆中提取的可溶性HLA-G分子，也能抑制NK细胞和CTL介导的细胞裂解[3]。子宫腺肌症患者的病理改变主要表现为子宫内膜异常增生，因此，它与恶性肿瘤的发展有一定的相似性。研究发现子宫腺肌症患者的子宫内膜在白细胞介素-10(interleukin-10，IL-10)的刺激诱导下可表达大量的HLA-G，并且发现HLA-G主要在子宫腺肌症患者子宫内膜组织中的腺细胞中表达最多[4]，因此考虑在子宫腺肌症患者体内，免疫系统同样受到了HLA-G的影响，为了进一步探索HLA-G与免疫系统的关系，本实验在以上研究的基础上，从临床提取20例子宫腺肌症患者的子宫内膜组织，分离出腺细胞与相应患者外周血中的NK细胞共培养，在IL-10干预的条件下，检测HLA-G的表达并且分析NK细胞在HLA-G的影响下发生的变化。

1 材料与方法

1.1 试剂 DMEM F12培养基购自HyClone公司；胎牛血清购自Gibco公司；人淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物制品有限公司；磁珠分选试剂盒以及分选柱(MS柱)、分选架(MiniMACS Starting Kit)购自Miltenyi Biotec公司；流式检测抗体CD56(APC标记)、凋亡试剂AnnexinⅤ(FITC标记)、PI(PE标记)均购自BD公司。HLA-G ELISA试剂盒购自皓歌生物制品有限公司。

1.2 提取原代细胞 子宫内膜组织取自2015年5月1日至2015年9月31日在山东大学附属省立医院妇科因子宫腺肌病行子宫全切术的20例患者。具体方法为临床提取子宫腺肌症患者子宫内膜标本用F12保存并转移至实验室，将组织置于培养皿中，用D-hank's洗标本3次，尽量洗去红细胞及其他杂质。用眼科剪剪碎组织，使其呈浆糊状，转移标本至50 mL离心管，离心2 min，250 g。加入2倍体积胶原酶消化，37 ℃水浴50 min，每10 min震荡一次。随后从水浴中取出，加入3倍体积D-hank's液终止消化并震荡。取3个烧杯分别加入1∶1的D-hank's液与F12培养基(已加血清及双抗)。第1个烧杯上放100目滤网，将消化后的标本倒入过滤，收集滤过液。烧杯2放置400目滤网，将上述滤过液继续通过400目滤网，此时再次收集的滤过液为间质细胞。将滤过后的400目滤网反扣在烧杯3上，用D-hank's液冲洗400目滤网，此时的滤过液为腺上皮细胞。弃去间质细胞，将腺上皮细胞移入离心管，离心。用少量F12(已加血清)重悬。准备6个培养皿，加入1 mL培养基，并分别加入4滴左右腺上皮细胞，6个培养皿分为A、B、C三组，每组2个培养皿(即干预组与非干预组)，将细胞放置20 ℃二氧化碳孵箱孵育。24 h后换液。同时，三组培养皿的干预组中加入20 ng/mL的IL-10，非干预组加入等量培养基。

1.3 磁珠分选以及ELISA检测 加入IL-10干预24 h后，当日早上抽取上述内膜提供者血液，约10 mL。采用密度梯度离心法分离单核细胞。将单核细胞用生理盐水洗2遍，约10 min，250 g。随后去上清，将细胞移入EP管，加入适量MACS Buffer重悬细胞， 镜下计数。随后离心约300 g 10 min。取出上清液，加入40 μL MACS Buffer/107个，重悬细胞。加入10 μL NK cell biotin-antibody cocktail/107个，4℃冰箱静置约15 min，离心洗去抗体，加30 μL buffer/107个，重悬细胞。随后加入20 μL NK cell MicroBead cocktail/107个,4 ℃冰箱静置20 min，离心洗去多余磁珠。加入500 μL Buffer重悬细胞。用500 μL Buffer冲洗MS柱子。将细胞悬液倒入柱子，收集流出液体。继而用500 μL Buffer冲洗柱子3次收集流出液体，最终为浓缩NK细胞，约2.5 mL。镜下观察，细胞圆滑清亮。将NK细胞平均分至B、C 2组4个培养皿中(分配之前对C组的NK细胞分别计数)共培养。同时，A组的2个培养皿分别用酶联免疫吸附试验(enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)试剂盒检测HLA-G的表达。

1.4 流式检测以及细胞计数 共培养48 h后,B组分别上机进行流式检测。具体方法为先确定流式条件，取出部分标本，加入流式管，500 μL磷酸盐缓冲液洗细胞，100 μL磷酸盐缓冲液重悬细胞，分别加入CD56(APC标记)流式抗体、凋亡试剂AnnexinⅤ(FITC标记)、PI(PE标记)共3管，避光30 min，上流式机，确定条件。其中AnnexinⅤ(FITC标记)、PI(PE标记)在避光之前需要55 ℃水浴15 min。最后将3种流式试剂同时加入再次确定流式条件。随后从B组2个培养皿中各取约100 μL标本加入流式管，PBS约500μL洗细胞，随后100 μL磷酸盐缓冲液重悬细胞，各加入3种抗体试剂。避光30 min。随后磷酸盐缓冲液洗去抗体，500 μL磷酸盐缓冲液重悬细胞，上流式。分别检测2个样本APC标记的CD56信号以及凋亡信号(另取一管不加入抗体作为阴性对照)。随之算出B组中干预组与非干预组样本的凋亡率。同时C组2个培养皿在显微镜下分别利用细胞计数板进行计数，计算方法为，4个角的格子即64个格子的细胞数除以4乘以104，该结果与48 h前的计数结果进行对比。

1.5 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件，计数资料以其算术平均数表示，比较采用配对样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ELISA检测结果 A组中干预组与非干预组之间HLA-G的浓度改变有统计学意义，20例子宫腺肌症患者，干预组中HLA-G的浓度平均为11.2 ng/mL，非干预组中HLA-G的浓度平均为3.2 ng/mL，即非干预组HLA-G浓度低于干预组HLA-G浓度(P<0.05)。

2.2 流式细胞学结果 B组中，加入IL-10的干预组与未加入IL-10的非干预组NK细胞凋亡率分别平均为8.5 %与4.2 %。通过统计学计算发现干预组与非干预组之间NK细胞凋亡率差别不明显(P>0.05)。见图1。图中1A、2A、3A为干预组，4A、5A、6A为非干预组。1A、4A分别为干预组与非干预组所选的CD56(APC标记)阳性的细胞群，2A、5A是在所选定1A、4A中的细胞群中分别显示干预组与非干预组中CD56与凋亡试剂AnnexinⅤ(FITC标记)之间的关系，3A、6A也是在所选定1A、4A中的细胞群中分别显示干预组与非干预组中凋亡试剂AnnexinⅤ(FITC标记)与PI(PE标记)之间的关系，其中PI标记坏死细胞，所以图中Q4-2，即PI阴性同时AnnexinⅤ阳性的即为凋亡的NK细胞，其所占1A、4A细胞群的比例即为细胞凋亡率。

2.3 计数结果 C组中，将20例干预组48 h前后的细胞计数进行配对t检验，48 h前20例的细胞计数平均值约为2.5×105个/mL，48 h后20例的细胞计数平均值约为1.5×105个/mL。干预组48 h前后细胞计数变化有差异，即干预48 h后NK细胞计数减少(P<0.05)。同理，将20例非干预组48 h前后的细胞计数进行配对t检验，48 h前20例的细胞计数平均值约为1.7×105个/mL，48 h后20例的细胞计数平均值约为1.6×105个/mL。非干预组48 h前后细胞计数变化不明显，即非干预组48 h后NK细胞计数无明显变化(P>0.05)。

3 讨论

NK细胞即自然杀伤细胞，目前认为NK细胞是直接从骨髓中衍生的，在人的免疫机制中起着至关重要的作用[5]，可以认为是免疫系统的一个代表，一旦NK细胞受损就会导致机体免疫功能下降，从而罹患各种疾病。由本实验结果可看出，在相同条件下，加入IL-10的干预组有大量的HLA-G表达，非干预组只有少量的HLA-G表达，这也证实了以往的实验结论。另一方面，在大量HLA-G表达的干预组中，与NK细胞共培养一段时间后，干预组的NK细胞数少于非干预组的NK细胞数。这进一步表明NK细胞受到了HLA-G的影响，并且表现为抑制作用。然而B组中，干预组的NK细胞凋亡率与非干预组相比并没有明显的变化，这与预期结果相反，考虑可能HLA-G抑制NK细胞的机制并不是通过影响其凋亡率，亦或是由于实验技术水平欠佳导致。总之，子宫腺肌症患者的免疫系统确实受到了HLA-G的负面影响。除此之外，既然HLA-G可以抑制NK细胞，并且鉴于子宫腺肌症与一些恶性肿瘤的发生发展有一定的相似性，那么可以据此推测，在肿瘤的发生发展过程中，HLA-G起到了很大的作用。而具体作用或许是一方面介导了肿瘤细胞的免疫耐受，逃避了NK细胞的杀伤。并且有研究发现HLA-G可直接抑制免疫细胞的功能，其原因被确认是以其表面表达的一种或更多的HLA-G抑制性受体为基础。HLA-G是3种抑制性受体的配体，这些受体差异性的表达在B、T淋巴细胞、蜕膜和外周血的NK细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞上，一旦这些受体与配体特异性结合，即可使NK细胞失去其杀伤功能，从而使肿瘤细胞逃避免疫细胞的攻击。并且HLA-G的细胞亚群影响的研究显示，HLA-G能抑制NK细胞的杀伤功能、CD8+T细胞的抗原特异性杀伤功能及CD4+T细胞的同种异体的增殖反应。有相关文献提示HLA-G在肿瘤组织中发挥作用是依靠改变肿瘤局部微环境，抑制局部NK细胞的肿瘤杀伤作用，产生局部免疫耐受，使肿瘤组织逃脱机体的免疫监视，最终产生免疫逃逸作用。另一方面是抑制了免疫细胞，从本实验可推测，NK细胞的减少与HLA-G的表达有着密不可分的关系，根据HLA-G使肿瘤细胞发生免疫逃避的机制，可推测HLA-G应该同样作用于NK细胞表面某种表面受体，如KIR2DL4，从而导致NK细胞寿命缩短即发生凋亡。具体机制尚有待研究。总而言之，HLA-G通过在子宫腺肌症患者子宫内膜中大量表达，从而影响患者的免疫功能，导致疾病不断发展恶化。

[1] 王飞.免疫耐受相关分子HLA-G和IL-10在子宫腺肌病中的表达及意义[D].济南：山东大学,2008.

[2] Barrier BF,Kendall BS,Ryan CE,et al.HLA-G is expressed by the glandular epithelium of peritoneal endometriosis but not in eutopic endometrium[J].Hum Reprod,2006,21(4),864-869.

[3] Bruner-Tran KL,Carvalho-Macedo AC,Duleba AJ,et al.Experimental endometriosis in immunocompromised mice after adoptive transfer of human leukocytes[J].Fertil Steril,2010,93(8),2519-2524.

[4] 石珊珊,王飞,杨钟莉.rIL-10诱导下子宫腺肌病患者子宫内膜细胞HLA-G的表达变化[J].新医学,2013,44(3):157-161.

[5] Fang JC,Zhou J,Li Z,et al.Primary extranodal NK/T cell lymphoma, nasal-type of uterus with adenomyosis:a case report[J].Diagn Pathol,2014,9:95-98.

Effect of HLA-G on NK cells in endometrial cells extracted from adenomyosis patients induced by IL-10

WANG Ziyue,WANG Fang

(1.BaotouMedicalcollege,Baotou014040,China;2.TheFirstAffiliatedhospitalofBaotoumedicalcollege,Baotou014000,China)

Objective:To observe the effects of human leucocyte antigen-G(HLA-G) on natural killer (NK) cells when endometrial tissue extracted from adenomyosis patients and peripheral blood NK cell are added with interleukin-10(IL-10) to produce HLA-G. Method:20 cases of uterine adenomyosis patients were selected to extract endometrial tissue successively. With tissue cells separated and interstitial cell abandoned, the remaining gland cells were divided into group A, B and C, with two parts in each group, the intervention group and non-intervention group. Cells in the three groups were cultured in vitro with 10 % fetal bovine serum and 1 % of the double resistance DMEM F12 medium. IL-10 (20 ng/mL) was added into the intervention group and the same amount of medium into the non-intervention group. 24 hours later, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) method was adopted to detect the expressions HLA-G in the two groups. The immunomagnetic sand method was then used to sort out CD 56+mononuclear cells, namely the NK cells, from human peripheral blood mononuclear cells. The sorted NK cells and cells in group B and C were co-cultured. 48 hours later, flow cytometry was performed to analyze the NK cells apoptosis ratio in group B. Counting method was used to count cells in group C. Results:In group A, HLA-G concentration averaged 11.2 ng/ml in the intervention group and 3.2 ng/ml in the non-intervention group. In group B, the NK cells apoptosis rates averaged 8.5 % and 4.2 % respectively in the intervention group and in the non-intervention group. In group C, NK cells counting in the intervention group and in the non-intervention group averaged 2.5×105/mL and 1.7×105/mL, with an average of 1.5×105/mL and 1.6×105/mL 48 hours later. Conclusion:IL-10 significantly increased the expression of HLA-G with no obvious effects on NK cells apoptosis, while the number of NK cells decreasing significantly showed HLA-G has certain inhibitory effect on NK cells.

Human leukocyte antigen-G; NK cell; Adenomyosis; Endometrial glandular cell

王 芳

2015-09-04)