MLK3在胃癌中的表达及其临床意义

岳燕科，闫 斌，于跃利

(1.包头医学院第一附属医院，内蒙古包头 014010；2.包头医学院2013级研究生)



MLK3在胃癌中的表达及其临床意义

岳燕科1,2，闫 斌1，于跃利1

(1.包头医学院第一附属医院，内蒙古包头 014010；2.包头医学院2013级研究生)

目的：研究混合谱系激酶3(mixed lineage kinase 3，MLK3)在胃癌组织中的表达及临床意义。方法：采用免疫组织化学法检测65例胃癌组织、65例癌旁组织以及18例正常胃黏膜组织中MLK3的表达情况。结果：MLK3在正常胃黏膜组织中的阳性表达率为11.11 %，在胃癌及癌旁组织中阳性表达率分别为81.54 %和35.38 %，胃癌组织中MLK3的表达水平分别高于癌旁组织及正常胃黏膜组织(P<0.05)，其表达水平与肿瘤的分化程度、淋巴结转移情况、TNM分期有关(P<0.05)，而与患者的年龄、性别、肿瘤直径、浸润程度无关(P>0.05)。结论：MLK3表达水平升高与胃癌密切相关，可能参与胃癌的发生、侵袭和转移过程。

胃癌；MLK3；免疫组化；信号通路

丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)信号通路是真核生物信号传递网络中的重要途径之一，介导于多种信号通路转导过程，参与细胞周期调控。另外，MAPK信号通路可被多种细胞外刺激因子激活，参与多种恶性肿瘤的发生发展，成为近年研究的热点[1]。

混合谱系激酶3(mixed lineage kinase 3，MLK3)的分子量约为97 kDa，可以激活MAPK信号通路。MLK3及其家族成员已被证实在乳腺癌、卵巢癌、大肠癌等多种恶性肿瘤中异常表达，其活化后参与调节细胞生长、增殖、分化及凋亡，诱导癌细胞迁移、侵袭等多种生物学活动[2]。近年来，MLK3在胃癌中的作用报道相对较少。为了更进一步了解MLK3与胃癌的关系，本研究采用免疫组织化学方法检测MLK3在人胃癌组织、癌旁组织及正常胃黏膜组织中的表达情况，分析其在胃癌发生、发展中的作用。

1 对象与方法

1.1 对象 选取2014年2月至2015年9月包头医学院第一附属医院手术切除的原发性胃癌标本65例，所有患者术前均未行放疗、化疗等相关治疗，且具备完整临床病理资料，术后经病理证实均为胃腺癌。其中男性49例，女性16例；年龄(61.0±9.4)岁；高分化腺癌18例，中低分化腺癌47例；癌组织局限于黏膜及黏膜下层者11例，浸润深度超过肌层以上者54例；伴有淋巴结转移50例，未转移15例。TNM分期：Ⅰ期+Ⅱ期共23例，Ⅲ期+Ⅳ期共42例。设立胃癌组65例、癌旁组(65例与癌灶距离>5 cm的正常组织)和正常对照组(18例胃镜下取的正常胃黏膜标本)进行比较分析。

1.2 试剂与方法 兔抗人MLK3抗体(bs-2992R)购自北京博奥森生物技术有限公司；免疫组化试剂盒购自福州迈新生物技术有限公司。首先，取所有组织进行常规石蜡包埋、切片(厚度4 μm)、脱蜡至水化，采用柠檬酸钠缓冲液高温抗原修复，3 % H2O2室温孵育5 min，以阻断内源性过氧化物酶活性；蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min；滴加正常山羊血清，室温孵育30 min，以封闭非特异性反应部位；倾去血清，勿洗，滴加兔抗人MLK3抗体(工作浓度1∶200)，4 ℃孵育过夜，次日37 ℃复温20 min，PBS冲洗3次，5 min/次；滴加生物素化山羊抗兔IgG，37 ℃孵育20 min；PBS冲洗3次，5 min/次；滴加辣根酶标记链霉卵白素过氧化物酶工作液，37 ℃孵育30 min；PBS冲洗3 次，5 min/次；用新鲜配制的DAB显色液染色，并于显微镜下控制着色情况，蒸馏水适时终止显色。常规冲洗、苏木素复染、脱水、透明、封片。光学显微镜下观察各组MLK3的阳性表达情况并进行摄片。

1.3 结果判定 以细胞浆呈现棕黄色颗粒沉着为阳性染色。每张切片随机观察10个200倍视野，取其均值，每个视野计数100个细胞。根据阳性细胞的染色强度和阳性细胞数量两项指标综合评分判定。染色强度：无染色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；阳性细胞百分数(阳性细胞总数/视野内细胞总数)：无阳性细胞为0分，<25 %为1分，26 %～49 %为2分，>50 %为3分。将2项评分标准相乘，得出综合评分：0～3分为阴性，4～6分为阳性(+)，>7分为强阳性(++)。

1.4 统计学处理 实验数据均采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，计数资料的比较采用χ2检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 MLK3在胃癌组织、癌旁组织及正常胃黏膜组织中的表达 光镜下可见MLK3的阳性反应产物定位于细胞浆，呈棕黄色/棕褐色颗粒状或块状。在部分胃癌组织中，癌细胞胞浆内可见大量深染棕褐色颗粒，呈强阳性；部分胃癌组织癌细胞胞浆内则可见棕黄色颗粒，呈现阳性反应；而在大多数癌旁组织及正常胃黏膜组织中，细胞浆中未见阳性反应产物。见图1。

A：胃癌组织中MLK3表达强阳性(++)；B：胃癌组织中MLK3表达阳性(+)；

C:胃癌旁组织中MLK3阴性(-)；D：正常胃黏膜组织中MLK3阴性(-)。

MLK3阳性表达细胞如箭头所示。

胃癌组MLK3的阳性表达率为81.54 %，癌旁组和正常对照组中MLK3的阳性表达率分别为35.38 %和11.11 %。胃癌组MLK3的阳性表达率分别高于癌旁组和正常对照组(P<0.05)；癌旁组和正常对照组的MLK3阳性表达率比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

2.2 MLK3在胃癌中的表达与临床病理学特征的关系 MLK3的表达与患者年龄、性别、肿块大小、浸润深度无明显关系(P>0.05)。MLK3在高分化腺癌的阳性表达率为55.56 %,在中低分化腺癌的阳性表达率为91.49 %，二者对比，差异具有统计学意义(P<0.05)。有淋巴结转移的胃癌组织MLK3阳性表达率为94.00 %，无淋巴结转移的胃癌组织MLK3的阳性表达率为40.00 %，二者对比，差异具有统计学意义(P<0.05)。在胃癌的分期中可见，Ⅰ+Ⅱ期胃癌中MLK3阳性表达率为56.52 %，Ⅲ+Ⅳ期胃癌中MLK3阳性表达率为95.24 %，二者对比，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表1 MLK3在胃癌组织、癌旁组织及正常胃黏膜组织中的表达

a为与癌旁组比较，P<0.05；b为与正常对照组比较，P>0.05；c为与胃癌组比较，P<0.05

表2 MLK3在胃癌中的表达与临床病理学特征的关系

临床病理特征NMLK3的表达阴性(-)阳性(+)强阳性(++)阳性率(%)P年龄(岁) <60 ≥6027385617752581.4884.211.000性别 男 女49166633910187.7662.500.057肿瘤直径 >4cm ≤4cm31343923195690.3273.530.113分化程度 高分化 中低分化1847846364755.5691.490.002浸润程度 黏膜及黏膜下层 肌层以上115421083411081.8281.481.000淋巴结转移 有 无5015393849294.0040.000.000TNM分期 Ⅰ+Ⅱ Ⅲ+Ⅳ23421028345656.5295.240.000

3 讨论

我国是胃癌高发区，且胃癌的发病年龄趋于年轻化。到目前为止，外科手术仍是治疗胃癌最有效的手段，但鉴于早期胃癌的诊断困难及其独特的生物学特性，预后较差，化疗和放疗效果亦不理想[3]。近年来，随着人们在肿瘤分子生物学和分子靶向治疗上的诸多发现，对胃癌的诊断和治疗也有了全新的认识。

研究表明，多种细胞信号通路参与肿瘤的发生发展，而MLK3是一种新近发现的肿瘤相关基因，已被证实参与多种肿瘤相关的信号转导通路，但具体作用仍不清楚。MLK3由1个SH3结构域、1个激酶结构域、双重亮氨酸拉链、1个Cdc42/Rac互动结合模体和一个富含脯氨酸的C-端组成。MLK3以其独特的分子形式处于自身抑制状态，而MLK3的活化可由多种信号刺激介导[4]。另外，肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)、热休克蛋白90等也可参与MLK3信号通路的调节。由此可见，MLK3的活性是受多种因素调节的。有文献报道MAPK家族中的c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)、细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)在多种恶性肿瘤中异常表达，参与癌细胞的迁移和侵袭过程[5]。而MLK3作为MAPK信号通路的上游激酶，其激活与否对调节MAPK信号通路具有重要意义。

有研究发现，胃泌素(G17)可以促进胃癌细胞的迁移及侵袭，而此过程主要是依靠MLK3/JNK信号通路来实现的。在对目标细胞使用了MLK3抑制剂CEPl347或JNK抑制剂SP600125进行干预处理之后，这种迁移和侵袭过程会明显减弱[6]。为了更进一步了解MLK3与胃癌的关系，本研究采用免疫组织化学法检测65例胃癌组织及其癌旁组织、18例正常胃黏膜组织中MLK3的表达情况。结果发现MLK3在胃癌组织相对于癌旁组织及正常胃黏膜组织表达增高，且与分化程度、病理学转移、分期特征密切相关，说明MLK3可能是导致胃癌发生、发展的因素之一，MLK3高表达是胃癌发生中重要的分子事件。

综上所述，MLK3在胃癌的发生发展过程中具有重要作用，检测MLK3蛋白有望成为提高早期胃癌诊断率及评价患者预后的重要手段。但MLK3高表达引起胃癌发生的确切机制尚需进一步研究。

[1] Haagenson Kelly K,Wu GS.The role of MAP kinases and MAP kinase phosphatase-1 in resistance to breast cancer treatment[J].Cancer and Metastasis Reviews,2010,9:143-149.

[2] Kovalenko PL,Kunovska L,Chen J,et al.Loss of MLK3 signaling impedes ulcer healing by modulating MAPK signaling in mouse intestinal mucosa[J].American Journal of Physiology Gastrointestinal & Liver Physiology,2012,303(8):G951-G960.

[3] 郭澎涛,王振宁,徐惠绵,等.不同生物学行为胃癌的外科治疗[J].中国普外基础与临床杂志,2014,21(1):12-15.

[4] Zhan Y,Chadee DN.Inhibition of Cdc42-mediated activation of mixed lineage kinase 3 by the tumor suppressor protein merli[J].Small Gtpases,2010,1(3):183-186.

[5] Wang AY.Gentiana manshurica Kitagawa prevents acetaminophen-induced acute hepatic injury in mice via inhibiting JNK/ERK MAPK pathway[J].World Journal of Gastroenterology,2010,16(3):384-391.

[6] Mishra P,Senthivinayagam SV,Sondarva G,et al.Mixed lineage kinase-3/JNK1 axis promotes migration of human gastric cancer cells following gastrin stimulation[J].Molecular Endocrinology,2010,24(3):598-607.

于跃利

2016-01-05)