葛根素-壳寡糖共无定型制备与体外溶出度评价*

任丽佳，李 杰，唐丽娜△

（1.南京中医药大学江阴附属医院，江苏 无锡214400；2.南京中医药大学附属张家港医院，江苏 张家港 215600）

葛根素是中药葛根中提取的主要有效成分，是一种异黄酮类化合物，临床应用广泛，主要用于治疗心绞痛、高血压、冠状动脉粥样硬化性心脏病等疾病［1−2］。但其水溶性差，口服生物利用度低，临床应用受到限制［3−5］。无定型技术通过破坏药物晶格，可有效改善难溶性药物的溶解度/溶出度。无定型固体分散体（ASD）技术通过添加载体来提高无定型药物的物理稳定性［6−7］，载体包括高分子聚合物类和表面活性剂类，但其较强的引湿性均导致物理稳定性差，此外还有与药物混溶性差、胃肠道副作用等问题，且用量较大导致药物服用量大。共无定型技术具有更高的物理稳定性和更好的溶出表现，已成为ASD的替代技术。与单一无定型药物相比，共无定型药物除物理稳定性好外，当配体为活性成分时，还可产生协同治疗、较少副作用等联合治疗效果。壳寡糖也称几丁寡糖，是壳聚糖的水解产物，天然环保，相对分子质量小，水溶性良好，黏度低［8］，还具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗肿瘤等多种药理活性［9−12］。壳寡糖作为一种生物利用度增强剂，可打开细胞间的紧密连接，提高药物的肠道吸收，增强药物的生物利用度［11−12］。本研究中选择壳寡糖为共无定型的新型药物配体，与葛根素共同制备葛根素−壳寡糖共无定型（PUE−COS CM），采用多种固态表征方法进行分析，并评价其在漏槽和非漏槽2种条件下的体外溶出表现。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters 2695型高效液相色谱仪（美国Waters公司）；Bromanil C18柱（250 mm×4.6 mm，5µm）；SPEX 6770型冷冻研磨机（美国SPEX公司）；CPA 225D型电子分析天平（南京以马内利仪器设备有限公司，精度为十万分之一）；Q2000型示差扫描量热仪（美国TA公司）；D/max 2500型X−射线粉末衍射仪（日本Rigaku公司）；SNE−4500型扫描电镜仪（日本Hitachi公司）；Bruker−TENSOR37型红外光谱仪（德国Bruker Optics公司）；HY68/RCY−1型智能溶出试验仪（北京中西远大科技有限公司）；LHH−350CFS型综合药品稳定试验箱（上海凯朗仪器设备厂）；Milli−Q型超纯水系统（美国Millpore公司）；KH−500DE型数控超声清洗仪（昆山超声仪器有限公司，功率为250 W，频率为40 kHz）；MX−F型涡旋仪（大龙兴创实验仪器股份<北京>有限公司）。

1.2 试药

葛根素原料药（上海泰坦科技股份有限公司，批号为5214C，纯度大于98%）；壳寡糖（浙江金壳药业有限公司，批号为M−KG−1708001，相对分子质量1 000，脱乙酰度大于90%）；甲醇（色谱纯，美国Tedia有限公司）；氢氧化钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；葛根素对照品（批号为P111269，纯度大于98%），磷酸二氢钾（分析纯），均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 样品制备

PUE−COS CM：将总质量为1 g的葛根素与壳寡糖［质量比1∶1（m/m）］混匀，采用低温研磨法制备PUE−COS CM。置充满液氮的低温室，以10 Hz的频率研磨5 min，冷却2 min，按此步骤循环，低温研磨30 min。样品置真空干燥箱中干燥24 h，保存于干燥器中，备用。同法制备低温研磨葛根素。

葛根素−壳寡糖物理混合物（PUE−COS PM）：取总质量为1 g的葛根素与壳寡糖混合物［质量比1∶1（m/m）］，置50 mL离心管中，置涡旋仪上涡旋40 min，使葛根素和壳寡糖充分混匀，即得PUE−COS PM，保存于干燥器中，备用。

2.2 高效液相色谱法测定含量

2.2.1 色谱条件

色谱柱：Bromanil C18柱（250 mm×4.6 mm，5µm）；流动相：甲醇−水溶液（51∶49，V/V）；流速：1 mL/min；柱温：30℃；检测波长：250 nm；进样量：10µL。

2.2.2 方法学考察

线性关系考察：取葛根素对照品4.825 mg，精密称定，置10 mL容量瓶中，加甲醇适量，超声（功率为250 W，频率为40 kHz）使溶解，定容，振荡摇匀，配制成质量浓度为482.5µg/mL的对照品贮备液。精密吸取500µL，稀 释 成 质 量 浓 度 分 别 为1.88，3.80，7.54，15.08，30.16，60.31，120.63，241.25，482.50 µg/mL的系列对照品溶液，按2.2.1项下色谱条件进样测定。分别以葛根素质量浓度（X，µg/mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y=40 524X−3 145.8（R2=0.999 9，n=9）。结果表明，葛根素质量浓度在1.88～482.50µg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：吸取线性关系考察项下质量浓度分别为3.80，60.31，241.25 µg/mL的葛根素对照品溶液，按2.2.1项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果葛根素峰面积的RSD分别为2.53%，0.98%，1.14%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取PUE−COS CM适量，精密称定，置25 mL容量瓶中，加甲醇超声（功率为250 W，频率为40 kHz）使溶解，振荡摇匀，定容，即得葛根素质量浓度为62.16µg/mL的溶液，分别于0，2，4，8，12，24 h时按拟订色谱条件进样测定。结果葛根素峰面积的RSD为1.87%（n=6），表明PUE−COS CM溶液在24 h内稳定性良好。

重复性试验：按稳定性试验项下方法平行制备6份PUE−COS CM供试品溶液，按2.2.1项下色谱条件进样测定。结果葛根素含量的RSD为1.76%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取6份已知含量的PUE−COS CM适量，精密称定，分别加入等量葛根素对照品，按稳定性试验项下方法制备供试品溶液，按2.2.1项下色谱条件进样测定。结果PUE−COS CM中葛根素的平均加样回收率为96.05%，RSD为2.68%（n=6）。

2.3 PUE-COS CM表征分析

差示扫描量热法：分别取葛根素原料药、壳寡糖、PUE−COS PM、低温研磨葛根素、PUE−COS CM各适量（5～10 mg），置铝坩埚中，置Q2000型示差扫描量热仪中分析，测定条件为，升温速率10℃/min，升温范围50～250℃，氮气流速50 mL/min。结果见图1 A。可见，葛根素原料药在75.4～157.8℃间存在明显失水峰，在191.4～219.2℃间有一尖锐吸热峰，该吸热峰为葛根素原料药的晶体熔化峰（图1 a波）；壳寡糖在50.0～145.8℃间存在明显失水峰，在215.2～234.5℃间存在明显吸热峰，该吸热峰由壳寡糖发生降解所致（图1 b波）；PUE−COS PM在191.4～234.5℃间存在吸热峰，该峰由葛根素原料药晶体熔化峰与壳寡糖降解峰叠加所致（图1 c波）；低温研磨葛根素在191.4～219.2℃间存在葛根素原料药的晶体熔化峰，表明通过低温研磨不能使葛根素原料药晶体完全转变成无定型状态（图1 d波）；PUE−COS CM中葛根素的晶体熔化峰完全消失，并存在单一的玻璃化转变温度（95.7℃），表明通过低温研磨成功制备为共无定型系统（图1 e波）。

X射线粉末衍射法：分别取葛根素原料药、壳寡糖、PUE−COS PM、低温研磨葛根素、PUE−COS CM各适量，平铺于载玻片上，置D/max 2500型X−射线粉末衍射仪分析，测定条件为，Cu靶（40 kV，40 mA），扫描范围3°～40°（2θ），扫描速率2°/min，步长0.02°。结果见图1 B。可见，葛根素原料药在6.5°，7.9°，8.7°，11.5°，13.8°，15.9°，16.8°，18.1°，18.9°，19.6°，21.0°，23.4°，26.2°

等处有较强的晶体衍射峰（图1 f波）；壳寡糖在3°～40°范围内无晶体衍射峰，表明壳寡糖以无定型形式存在（图1 g波）；在PUE−COS PM中，葛根素原料药的晶体衍射峰仍然存在（图1 h波）；低温研磨葛根素中，葛根素原料药的晶体衍射峰显著减弱，部分衍射峰消失，但仍存在部分晶体衍射峰，表明低温研磨仅能在一定程度上破坏葛根素原料药的晶格，不能完全使其晶体转变为无定型状态（图1 i波）；PUE−COS CM中，葛根素原料药的晶体衍射峰全部消失，表明成功制备了PUE−COS CM（图1 j波）。

a，f，k.葛根素原料药b，g，l.壳寡糖c，h，m.PUE−COS PM d，i，n.低温研磨葛根素e，j，o.PUE−COS CMA.差示扫描量热法B.X射线粉末衍射法C.傅里叶红外光谱法图1表征分析图a，f，k.PUE API b，g，l.COS c，h，m.PUE−COS PM d，i，n.PUE ground by the cryomilling method e，j，o.PUE−COS CMA.DSC B.XRPD C.FTIRFig.1 Phenograms of characterization analysis

A.葛根素原料药B.壳寡糖C.PUE−COS PM D.PUE−COS CM图2扫描电镜图A.PUE API B.COS C.PUE−COS PM D.PUE−COS CMFig.2 SEM images

傅里叶红外光谱法：分别取葛根素原料药、壳寡糖、PUE−COS PM、低温研磨葛根素、PUE−COS CM各适量，采用Bruker−TENSOR37型红外光谱仪分析，测定条件为，扫描波数范围4 000～600 cm−1，分辨率2 cm−1。结果见图1 C。可见，葛根素原料药的主要特征吸收峰为于3 379 cm−1波数处存在－OH的伸缩振动，在1 628 cm−1波数处存在C＝O的伸缩振动（图1 k波）；壳寡糖的主要特征吸收峰为在1 608 cm−1波数处存在酰胺Ⅰ的C＝O伸缩振动（图1 l波）；PUE−COS PM中，葛根素和壳寡糖的主要特征吸收峰仍然存在（图1 m波），表明在物理混合物中，葛根素和壳寡糖间未发生相互作用；与葛根素原料药相比，低温研磨葛根素的红外吸收峰未发生明显变化（图1 n波）；PUE−COS CM中，葛根素于3 379 cm−1波数处的－OH特征峰消失，壳寡糖在1 608 cm−1波数处的C＝O伸缩振动明显减弱，表明葛根素与壳寡糖间发生了潜在的分子间氢键相互作用（图1 o波）。

扫描电镜分析：分别取葛根素原料药、壳寡糖、PUE−COS PM、PUE−COS CM各适量，均匀撒于贴有导电胶带的样品座上，喷金5 min，用镊子取出，置SNE−4500型扫描电镜仪，采用3 000 V的加速电压扫描其表面，并拍照。结果见图2。可见，葛根素原料药具有明显的长片状特征，形状规则（图2 A）；壳寡糖为大小不一的规则球形（图2 B）；PUE−COS PM中，葛根素原料药的长片状特征和壳寡糖的球形特征仍然存在（图2 C）；PUE−COS CM呈颗粒状、不规则块状，且粒径减小，葛根素原料药的长片状特征和壳寡糖的球形特征均完全消失（图2 D）。

2.4 体外溶出试验

漏槽条件下：取葛根素原料药、PUE−COS PM、低温研磨葛根素、PUE−COS CM（相当于6 mg葛根素原料药）各适量，精密称定，按2015年版《中国药典（四部）》附录XC溶出度测定法进行体外溶出试验，溶出介质为磷酸盐缓冲液（pH 6.8），介质体积为900 mL，温度为（37±0.5）℃，转速为50 r/min，分别于2，5，10，20，30，45，60 min时取样3 mL，并随即补足等温度、等量的溶出介质，经0.45 µm微孔滤膜滤过，按2.2.1项下色谱条件进样测定3次，计算各时间点的葛根素累积溶出率。体外溶出曲线见图3 A。可见，在漏槽条件下，葛根素原料药与PUE−COS PM溶出曲线相似；与葛根素原料药相比，低温研磨葛根素的累积溶出率稍提高，主要是由于低温研磨后，葛根素原料药粒径减小，其与溶出介质的接触表面积增大；与葛根素原料药相比，PUE−COS CM的累积溶出率显著提高。5 min时，PUE−COS CM中葛根素的累积溶出率为76.25%，而葛根素原料药仅为35.97%（P<0.01）；10 min时，PUE−COS CM中葛根素的累积溶出率为85.26%，而葛根素原料药仅为50.79%（P<0.01）。由于PUE−COS CM自由能更高，且药物粒径减小，导致PUE−COS CM中葛根素的累积溶出率显著提高。

非漏槽条件下：取葛根素原料药、PUE−COS PM、低温研磨葛根素、PUE−COS CM（相当于30 mg葛根素原料药）各适量，精密称定，按2015年版《中国药典（四部）》附录XC溶出度测定法进行体外溶出试验，溶出介质为磷酸盐缓冲液（pH 6.8），介质体积为200 mL，温度为（37±0.5）℃，转速为50 r/min，分别于0.25，0.50，0.75，1.00，1.50，2.00，4.00，6.00 h时各取样2 mL，并随即补足等温度、等量溶出介质，经0.45µm微孔滤膜滤过，用甲醇稀释1倍，按2.2.1项下色谱条件进样测定3次，计算各时间点葛根素的溶出质量浓度。体外溶出曲线见图3 B。可见，在非漏槽条件下，葛根素原料药与PUE−COS PM的体外溶出曲线相似，2 h后趋于稳定；低温研磨葛根素在0.5 h时的溶出质量浓度达最大值（9.25µg/mL），然后下降并趋于平衡，这是由于低温研磨后，葛根素粒径变小，并可能存在部分无定型葛根素，导致溶出质量浓度稍高于葛根素原料药，晶型发生转变后，溶出质量浓度趋向于葛根素原料药平衡状态下的溶出水平；与葛根素原料药和PUE−COS PM比较，PUE−COS CM中葛根素的体外溶出质量浓度较高，且能长时间维持过饱和状态。在1.5 h时，PUE−COS CM中葛根素的溶出质量浓度达最大值（18.31µg/mL），是葛根素原料药（7.65 µg/mL）的2.39倍（P<0.01）；在1.5～6.0 h间，PUE−COS CM中葛根素的溶出质量浓度无明显下降，维持长时间的过饱和状态。

A.漏槽条件下B.非漏槽条件下图3葛根素体外溶出曲线A.Under sink condition B.Under non−sink conditionFig.3 Dissolution profiles of PUE in vitro

2.5 稳定性试验

物理稳定性：将PUE−COS CM置LHH−350CFS型综合药品稳定试验箱，在40℃条件下保存6个月。通过X射线粉末衍射法分析，判断PUE−COS CM是否发生晶型转变，以评价PUE−COS CM的物理稳定性。详见图4和图5。由图4可知，PUE−COS CM在40℃条件下保存6个月均未出现葛根素的晶体特征衍射峰，表明PUE−COS CM在6个月内未发生晶型转变，物理稳定性良好。可能由于在PUE−COS CM中，葛根素与壳寡糖分子间发生了氢键相互作用。由图5可知，PUE−COS CM放置6个月的溶出趋势与放置0 d基本一致，且溶出速率良好。这是由于低温研磨不会引起药物的热降解，且葛根素与壳寡糖分子间氢键相互作用较强，导致PUE−COS CM物理稳定性良好。

图5 PUE-COS CM 40℃条件下放置0 d和6个月的溶出曲线Fig.5 Dissolution profiles of PUE-COS CM at 40℃for 0 day and six months

化学稳定性：按2.1项下方法制备PUE−COS CM，于40℃条件下放置6个月，按2.2.1项下色谱条件进样测定3次，记录峰面积，并计算含量。结果新鲜制备的PUE−COS CM中葛根素的含量为（0.506±0.005）g/g，40℃条件下放置6个月的PUE−COS CM中葛根素的含量为（0.503±0.008）g/g，表 明PUE−COS CM在40℃条件下放置6个月的化学稳定性良好。

a.0 d b.1个月c.3个月d.6个月图4 PUE-COS CM 40℃条件下放置6个月的X射线粉末衍射图a.0 d b.One month c.Three months d.Six monthsFig.4 XRPD patterns of PUE-COS CM at 40℃for six months

3 讨论

为了提高难溶性药物的溶解度/溶出度，有效方法之一为改变药物晶型，将药物由晶体状态转变为无定型状态［13］。但无定型状态为高能态，热力学不稳定，随着时间的变化易发生重结晶，向稳定的晶型状态转变。目前，为了增加无定型药物的稳定性，通常将药物与高分子聚合物或表面活性剂等载体制备成ASD。当药物与载体混溶性较差时，为了达到药物的有效治疗剂量，一般使用大量的聚合物载体，造成服用量/体积较大。且大量聚合物易吸湿，引起药物转晶，降低ASD的稳定性。此外，使用大量高分子聚合物或表面活性剂还可能引起胃肠道毒性等问题［14−16］。共无定型是一种新型药物递送系统，指由药物和药物或药物和小分子配体组成的二元无定型系统，可有效改善难溶性药物的溶解度/溶出度，且物理稳定性好［17］。共无定型的小分子配体主要包括氨基酸（脯氨酸、精氨酸、苯丙氨酸等）、有机酸（柠檬酸、苹果酸、酒石酸等）等。其中，低分子量糖类（蔗糖、甘露醇、葡萄糖等）作为配体逐渐用于共无定型。壳寡糖为亲水性载体，天然环保，无毒副作用，生物相容性较好，且具有多种药理学活性，展现出作为共无定型优良配体的潜力，已被广泛用于药物制剂开发和生物医学领域，同时可作为吸收增强剂，提高难溶性药物的生物利用度。

本研究中，通过低温研磨成功将葛根素与壳寡糖制备成PUE−COS CM，方法简单易行，并采用多种表征分析技术对PUE−COS CM进行了分析。差示扫描量热和X射线粉末衍射分析结果表明成功制备了PUE−COS CM，这是由于低温研磨破坏了葛根素的晶格，导致其转变为无定型状态；傅里叶红外光谱分析发现，葛根素与壳寡糖分子间发生了潜在的氢键相互作用；扫描电镜观察发现，PUE−COS CM呈不规则块状与颗粒状，未见葛根素原料药的长片状和壳寡糖的球型特征。与葛根素原料药相比，PUE−COS CM在漏槽条件下葛根素的累积溶出速率更快，在非漏槽条件下的溶出质量浓度更高，且可长时间维持过饱和状态。这是由于PUE−COS CM中葛根素和壳寡糖发生了潜在的分子间氢键相互作用，抑制了共无定型中药物的成核和晶体生长［17−18］。此外，在过饱和系统中，药物的浓度高于药物的平衡溶解度，会促进更多游离的药物被人体吸收，且过饱和状态时间维持越长，药物的吸收效果越好［19］。

将葛根素原料药和壳寡糖制备成PUE−COS CM，可有效提高葛根素的体外溶出度，且可长时间维持过饱和状态，提高难溶性药物葛根素的生物利用度，且壳寡糖进一步扩大了共无定型的配体类型，为其他新型药用功能性辅料的开发和应用提供参考，也为解决其他难溶性药物的溶解度/溶出度及生物利用度问题提供新的思路。