胃癌病变中Runx3基因甲基化与幽门螺杆菌感染的关系

李 雪， 郭春林

(包头医学院，内蒙古包头 014060)



胃癌病变中Runx3基因甲基化与幽门螺杆菌感染的关系

李 雪， 郭春林

(包头医学院，内蒙古包头 014060)

目的:研究幽门螺杆菌(helicobacterpylori，Hp)感染、抑癌基因Runx3基因5′-CpG岛甲基化与胃癌的相关性。方法:收集2014年3月至2015年9月包头医学院第一附属医院消化内科门诊及住院患者56例经胃镜及病理确诊为胃癌者，70例对照组选自同期该院消化内科经胃镜及病理诊为慢性浅表性胃炎患者。所有受检者行胃镜前均行C13尿素呼气试验检测Hp感染情况。采用甲基化特异性聚合酶链式反应法检测胃癌组及对照组中Runx3基因的甲基化状态。结果:胃癌组Runx3基因甲基化率(53.6 %，30/56)高于对照组(7.1 %，5/70)(P<0.05)。胃癌组与对照组Hp感染差异有统计学意义(P<0.05)。Hp阳性胃癌组与Hp阴性胃癌组比较,Runx3基因甲基化差异有统计学意义(P<0.05)。结论:Runx3基因甲基化与胃癌发生有关，幽门螺杆菌感染增加抑癌基因Runx3基因5′CpG岛出现甲基化，导致胃癌的发生。

胃癌；甲基化；幽门螺杆菌；Runx3基因

胃癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤之一,其死亡率居全球肿瘤相关死亡的第2位。脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)甲基化是目前表观遗传修饰形式的研究热点。胃癌的发生与幽门螺杆(helicobacterpylori，Hp)感染关系密切，Hp感染是致癌因子中最重要的因素。Hp感染可能导致Runx3基因甲基化,使抑癌基因Runx3表达缺失而导致胃癌发生。本实验旨在探讨胃癌组与对照组之间的关系，及其Hp感染与胃癌病变中Runx3基因甲基化的关系。

1 对象与方法

1.1 对象

1.1.1 对象 56例胃癌组织为我院2014年3月至2015年9月经胃镜检查及病理确诊者，男性32例,女性24例,年龄24～69岁,平均年龄49.0岁；对照组为同时间内收集的慢性浅表性胃炎标本70例,男性40例,女性30例,平均年龄49.0岁。标本收集后立即保存到-80℃冰箱中。

1.1.2 试剂 组织基因组DNA提取试剂盒、甲基化DNA检测试剂盒等均购自康为世纪生物科技有限公司。

1.1.3 引物 Runx3甲基化引物:5′-TTACGAGGGGCGGTCGTACGCGGG-3′和5′-AAAACGACCGACGCGA ACGCCTCC-3′；Runx3非甲基化引物:5′-TTATGAGGGGTGGT TGTATGTGGG-3′和5′-AAAACAACCAACACAAACACCTCC-3′。

1.2 方法

1.2.1 Hp检测 56例胃癌组患者及70例对照组(近两周内均未服用过抗生素、铋剂、质子泵抑制剂等)检查前均行C13尿素呼气试验，空腹服用C13胶囊20 min后吹气留样，将专用的呼气卡放入同位素质谱仪内，全程诊断过程约45 min。此法是目前国际上公认的Hp检查的“金标准”，具有无交叉感染、无痛苦、无损伤和操作方便的优点。通过口服C13尿素胶囊进入胃部，如果有Hp，其会分解尿素酶进而水解尿素，尿素进一步被水解形成CO2从肺部以气体呼出，检测专用的呼气卡中是否有C13，如果有则表示存在Hp。诊断标准：DOB值>4.4为Hp阳性，DOB值<3.6为Hp阴性。

1.2.2 组织DNA提取 取30 mg冻存组织彻底研磨后，按照组织基因组DNA提取试剂盒说明书进行DNA的提取，并置于-20 ℃冰箱暂存。

1.2.3 甲基化检测 按照甲基化检测试剂盒的说明对所提取的DNA经亚硫酸氢钠处理，把未甲基化的C转化成U，U再在后续的聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)中变成T。经甲基化修饰后的DNA放入-20℃冰箱保存备用。随后进行引物特异性的PCR，PCR总反应体系为25μL:DNA1 μL,10×Buffer 2.5 μL,氯化镁2.5 mmol/L,引物0.5 mmol/L,dNTP2.0 μL, Hotstar Taq0.3 μL，灭菌双蒸水16.2 μL。PCR反应条件:95 ℃ 5 min,95 ℃ 30 s,65 ℃ 30 s,55 ℃ 35 s,共35个循环,最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。每次PCR均设阴性对照,用灭菌双蒸水代替DNA进行PCR扩增。之后取10 μL扩增产物在配好的2 %的琼脂糖凝胶上电泳，并在紫外线灯下观察结果并拍照。

1.3 统计学分析 结果分析采用SPSS 17.0统计软件进行χ2检验或Fisher精确检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Hp感染 56例胃癌组患者中Hp阳性38例(67.9 %)，阴性18例(32.1 %),70例慢性浅表性胃炎患者中Hp阳性14例(20.0 %),阴性56例(80.0 %)，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 Runx3基因甲基化 56例胃癌组中有30例甲基化阳性(53.6 %)，对照组70例胃粘膜中5例甲基化阳性，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3 Hp、Runx3基因甲基化与胃癌的关系 38例Hp阳性胃癌患者中,Runx3基因甲基化18例(47.3 %),无甲基化20例(52.6 %)；18例Hp阴性胃癌患者中,Runx3基因甲基化3例(16.7%),无甲基化15例(83.3 %)(图2)，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

肿瘤的发生发展是多种复杂因素引起的，其中导致肿瘤发生的重要原因之一就是抑癌基因失活。幽门螺旋杆菌是导致胃癌发生的重要因素，已经得到公认，但是具体导致胃癌的分子机制尚不清楚，目前认为Hp本身并不分泌致癌物质，长期幽门螺杆菌感染可能导致胃粘膜的萎缩、肠化生、异型增生，可能导致胃癌发生。Runx3是近些年发现的新型抑癌基因，与胃粘膜细胞生长分化关系密切，正常组织细胞分化被抑制，生长凋亡平衡失调，可能导致胃癌的发生。抑癌基因Runx3位于人染色体1号短臂1p36.1，在人体内广泛存在其蛋白表达，一旦染色体1p36.1的蛋白表达出现异常，RUNX3基因表达缺失或失活可能导致肿瘤的发生。在人类肿瘤中几乎都存在CpG岛过甲基化的现象。Lvanon D等[1]发现，胃癌早期病变中Runx3基因表达下调约达40 %，而胃癌中晚期Runx3下调达90 %。Waki等[]研究胃癌患者术后病理标本发现，胃癌组织中有45 %的Runx3基因发生了甲基化，癌旁正常组织中有8 %。对胃癌组织中Runx3基因编码区突变进行检测，发现Runx3基因变答缺失是导致胃癌发生的主要原因之一。Zou等[3]研究发现胃癌组织标本中Runx3基因甲基化水平呈递增水平，而在正常胃黏膜标本中无RUNX3甲基化。张海元等[4]在对肝癌患者血浆中Runx3基因启动子的甲基化状态进行检测，发现其对肝细胞癌的早期诊断也有重要价值。唐国华等[5]免疫组化结果发现胃癌组织中Runx3表达缺失或减少为74.0 %(111/150)，PS法检测胃癌Runx3基因甲基化为10.7 %，表明胃癌病变中DNA甲基化与Runx3基因的功能状态之间存在相关性。Hp感染是胃癌发生的重要因素，本研究表明胃癌组中Hp感染率高于对照组。本研究胃癌组与对照组Runx3甲基化率分别为53.6 %(30/56)和7.1 %(5/70)，胃癌组织中Runx3基因的表达量高于对照组,且Runx3基因的高表达与幽门螺杆菌有关，得出幽门螺杆菌感染可能诱使Runx3基因甲基化,从而导致抑癌基因Runx3失去活，导致胃癌发生。

本研究结果表明,胃癌发生、发展过程中Runx3基因甲基化可能是关键的早期事件,可作为胃癌早期发现及诊治的重要参考因素，也可作为胃癌易感人群筛查的新型分子标记和胃癌早期诊断和基因治疗的靶点,为胃癌的发现和诊治提供依据。应用DNA甲基化转移酶抑制剂5-氮唑-2-脱氧胞苷与组蛋白去乙酰酶抑制剂曲古抑菌A的协同作用诱导去甲基化，使失活的抑癌基因甲基化逆转从而达到治疗胃癌的目的，从而改善预后及延缓胃癌的进展。肿瘤进展和转移通过检测抑癌基因甲基化可能作为胃癌早期诊断和控制胃癌的发生发展的分子标志物，复杂的肿瘤病因和表观遗传学之间的复杂关系仍待进一步研究。随着科学研究不断进步，一定会为肿瘤的诊治开辟新的理论和实践道路。

[1] 刘九思,王梦龙.胃癌中Runx3表达及其甲基化[J].江西医学院学报,2009,49(2):103-105.

[2] 何小兵,张海元.胃癌及癌旁组织中Runx3基因甲基化研究及临床意义[J].吉林医学,2012,33(2):227-228.

[3] 黄定鹏,赵亚刚.RUNX3启动子甲基化与胃癌发生发展的关系[J].华南国防医学杂志,2012,26(4):320-322.

[4] 张海元,赵薇,班静.血浆Runx3基因启动子甲基化检测诊断早期肝细胞癌的临床价值[J].山东医药,2009,49(5):76-77.

[5] 唐国华,赵强,贺修胜,等.Runx3基因启动子CpG岛甲基化对胃组织癌变影响的研究[J].中华肿瘤防治杂志,2012,19(14):1069-1073.

Correlation of Runx3 gene methylation and helicobacter pylori infection with gastric cancer

LI Xue, GUO Chunlin

(BaotouMedicalCollege, 014040Baotou,China)

Objective:To research the correlation of helicobacter pylori (Hp) infection and methylation in the 5'CpG island of Runx3 tumor suppressor gene with gastric cancer. Methods：56 cases of gastric cancer patients diagnosed and confirmed by endoscopy and pathology in Gastroenterology Department of the First Affiliated Hospital of Baotou Medical College from March 2014 to September 2015 were selected as gastric cancer group. 70 cases of chronic superficial gastritis patients during the same period in the hospital were selected as control group. C13 urea breath test was adopted to test Hp infection of all subjects prior to gastroscope. Methylation status of Runx3 gene was detected in the gastric cancer group and control group by Methylation-specific PCR (MSP). Results：Runx3 gene methylation rate in the gastric cancer group (53.6 %, 30/56) was higher than that in the control group (7.1 %, 5/70) and the difference was statistically significant (P<0. 05). There was significant difference in helicobacter pylori infection between the gastric cancer group and the control group (P<0.05). There was significant difference in Runx3 gene methylation between Hp-negative gastric cancer group and Hp-positive gastric cancer group (P<0.05). Conclusion：Runx3 gene methylation may be related to the incidence of gastric cancer. Helicobacter pylori infection increases the methylation of 5'CpG island of Runx3 tumor suppressor gene, leading to gastric cancer.

Gastric cancer; Methylation; Helicobacter pylori; Runx3 gene

郭春林

2016-03-04)