FK506 雷帕霉素滴眼液对内毒素诱导的大鼠葡萄膜炎的疗效观察

赵佳佳　黄一飞⋆

·实验研究·

FK506 雷帕霉素滴眼液对内毒素诱导的大鼠葡萄膜炎的疗效观察

赵佳佳黄一飞⋆

目的 观察FK506和雷帕霉素滴眼液对内毒素诱导的大鼠葡萄膜炎的治疗作用。方法 12只实验大鼠随机分为空白溶剂组、0.1%FK506组、0.2%雷帕霉素组，每组各4只，注射脂多糖24h开始分别滴空白溶剂、0.1%FK506、0.2%雷帕霉素滴眼液，4次/d裂隙灯观察摄像，并参照Hoekzema的方法记录临床评分，并进行病理学观察，比较用药组与对照组的差异。结果 成功建立大鼠葡萄膜炎模型，0.1%FK506组、0.2%雷帕霉素组的眼部症状评分在注射后1～2d、7d与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；3～6d与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05），病理学观察示0.1%FK506组、0.2%雷帕霉素组炎症细胞浸润明显小于对照组组。结论 0.1%FK506、0.2%雷帕霉素滴眼液均可有效抑制SD大鼠葡萄膜炎的发展。

FK506 雷帕霉素 滴眼液 葡萄膜炎

葡萄膜炎是眼部主要免疫性疾病之一，目前免疫抑制剂FK506、雷帕霉素治疗葡萄膜炎多为口服剂型［1-3］。FK506眼部局部使用治疗葡萄膜炎多在研究阶段，Whitcup等研究证实FK506脂质体滴眼液可以使内毒素诱导的葡萄膜炎的炎症细胞浸润明显减少［4］，Keiko等研究证明玻璃体腔注射FK506可以有效抑制实验性自身免疫性葡萄炎的发展［5］。雷帕霉素全身应用可以明显抑制葡萄膜炎的进程［6］，与环孢霉素A或FK506联用亦能抑制葡萄膜炎的进展，同时可减少药物使用剂量［7-9］，但局部应用研究较少。2012年1月至6月作者通过建立内毒素诱导的大鼠葡萄膜炎模型，明确FK506和雷帕霉素滴眼液对葡萄膜炎的治疗作用。

1　材料和方法

1.1材料 SD雄性大鼠，体重200～250g，SPF级，购自军事医学科学院实验动物中心，伤寒杆菌内毒素（美国sigma公司）；FK506由军事医学院制成滴眼液；雷帕霉素由军事医学院制成混悬滴眼液。裂隙灯显微镜（日本TOPCON公司），眼前节照相系统（日本TOPCON公司）。

1.2方法 （1）SD大鼠葡萄膜炎模型的建立：建立内毒素诱导的大鼠葡萄膜炎模型，将伤寒杆菌内毒素溶于生理盐水制成浓度为2g/L的溶液，取100μl注射于SD大鼠双后足底部［10］。于注射前及注射后第4h、12h、24 h、48h、7d进行裂隙灯检查，出现阳性体征即表明模型成功建。（2）实验分组：将12只SD大鼠随机分成3组，A组：空白溶剂组；B组：0.1%FK506组；C组：0.2%雷帕霉素组；注射后24h开始点药，6次/ d，持续注射7d。

1.3裂隙灯观察 于注射后4h、12h、24h、2d、3d、4d、5d、6d、7d进行裂隙灯检查并摄像，参照Hoekzema［11］的方法对临床表现进行评价与记分（见表1）。

表1　大鼠葡萄膜炎模型临床评分标准

1.4病理学观察 在注射脂多糖24h、4、7、11d后分别从每个组中取出一只大鼠处死后取整个眼球，在甲醛中固定24～36h，然后脱水，石蜡包埋，并进行连续切片（厚5μm），最后进行HE染色以进行病理学观察。1.5 统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件。计量资料用（x±s）表示，用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1症状体征观察 SD大鼠注射伤寒杆菌内毒素后，4h可观察到虹膜充血明显，随后出现房水闪辉，瞳孔缩小，前房渗出等葡萄膜炎表现，本次实验中葡萄膜炎表现在24～48h达到最高峰，并于7d基本消退。

2.2病理学观察 在注射脂多糖24h后处死大鼠并取整个眼球经瞳孔的矢状切面进行病理切片，可见大鼠虹膜睫状体明显充血，有炎症细胞如中性粒细胞、淋巴细胞的浸润，角膜后可见沉着物，脉络膜、及视乳头周围血管可见充血（见图1）。

图1　内毒素诱导的大鼠葡萄膜炎的病理学改变（注射脂多糖后24h）（×400）

2.3免疫抑制剂滴眼液抑制大鼠葡萄膜炎的观察 注射脂多糖后每日通过裂隙灯下观察各组大鼠眼部症状，根据症状进行评分。空白溶剂组、FK506组、雷帕霉素组均在注射脂多糖1d后，虹膜明显充血，并可见房水闪辉、前房渗出，瞳孔中度缩小；3～4d后空白溶剂组可见虹膜充血减轻，房水闪辉、前房渗出仍可见，瞳孔极度缩小，而FK506组、雷帕霉素组可见房水闪辉减轻、前房渗出减少，瞳孔缩小，未出现极度缩小；空白溶剂组5～6d后可见虹膜充血减轻，房水闪辉减轻，瞳孔较前增大，而FK506组、雷帕霉素组则在4～5d虹膜充血减轻，房水闪辉减轻，瞳孔略小；空白溶剂组7～11d基本消退，前房渗出较多的仍可留有少量渗出，而FK506组、雷帕霉素组在5～7d基本消退。

2.4三组各时点大鼠葡萄膜炎临床症状评分比较 见表2。

表2　三组各时间点眼部症状评分比较（x±s）

2.5免疫抑制剂滴眼液抑制大鼠葡萄膜炎的病理学观察 各组在脂多糖注射24h，4、7、11d后取眼球进行切片行病理学观察，可见虹膜、睫状体有中性粒细胞为主的炎症细胞浸润，房水中可见大量的蛋白渗出和中性粒细胞，脉络膜、视网膜也可见中性粒细胞浸润。雷帕霉素、FK506组的炎症细胞的消退明显快于空白溶剂组（见图2）。

图2　空白溶剂组、FK506组、雷帕霉素组的虹膜病理改变比较（×400）

3　讨论

葡萄膜炎的发病机制及药物疗效的相关研究通常通过动物模型进行，目前有较多公认的动物模型，包括内毒素诱导的葡萄膜炎（EIU）、实验性自身免疫性前葡萄膜炎（EAAU）、实验性自身免疫性葡萄膜视网膜炎（EAU）。EIU是由细菌内毒素脂多糖诱发的严重的急性眼前节炎症，可以代表急性前葡萄膜炎。本实验研究免疫抑制剂滴眼液的药效学，其作为一种局部治疗，效果依赖于局部免疫反应机制，适合作为急性前葡萄膜炎的治疗，因而本实验选用代表前葡萄膜的EIU作为滴眼液的药效学研究膜型。

内毒素或脂多糖是革兰阴性菌的细胞壁成分，其可以在注射2h内破坏血-房水屏障，导致白细胞（大多数细胞为中性粒细胞）浸润虹膜、睫状小体和房水；结膜中有时也可见中性粒细胞的浸润。本实验诱导的EIU模型在脂多糖注射后24h，4、7、11d观察到前葡萄膜包括虹膜、睫状体均有中性粒细胞为主的白细胞浸润，房水中可见大量的蛋白渗出和炎症细胞，角膜后可见沉着物，同时脉络膜、视网膜中可见血管充血及炎症细胞浸润。

虽然EIU中浸润的细胞主要是中性粒细胞，T淋巴细胞也在其病理过程中起重要作用。Kogiso等在抗T淋巴细胞单克隆抗体处理后的鼠中再使用内毒素诱导葡萄膜炎，可见房水中的蛋白和浸润的细胞均明显减少，其中抗CD4抗体可以显著抑制葡萄膜炎的进程，而抗CD8抗体则无此作用，因而T淋巴细胞及其释放的细胞因子在EIU的发生、发展中起重要作用［12］。T淋巴细胞参与EIU的病理过程可能为炎症反应使葡萄膜的抗原暴露，激活T细胞，初始CD4+T淋巴细胞在细胞因子IL-2、IL-12等的作用下分化为Th1细胞，Th1细胞分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α诱导产生细胞免疫［13］。而FK506通过抑制NF-AT进入细胞核内而抑制细胞因子如IL-2、TNF-α和IL-2受体的表达和转录［14］，从而可以阻断葡萄膜炎的发生。而雷帕霉素/FKBP复合物通过抑制mTORC1而抑制IL-2与其受体结合后介导的T细胞的增殖和分化，初始T细胞不能分化为效应T细胞，因而雷帕霉素单用或联合FK506或CSA可以通过抑制T细胞的增殖和分化而抑制葡萄膜炎的进程［15］。

本实验通过制剂的调整使难溶于水的FK506、雷帕霉素能进入眼内发挥治疗作用。日本研究所用的是FK506滴眼液中加入了蓖麻油、乙醇［16］。国内研制的FK506混悬滴眼液采用的是购自日本的FK506，并加入乙醇、Tween-80、聚乙烯氢、蓖麻油、羧甲基纤维素纳、聚乙二醇、柠檬酸钠、硫柳汞，并配置合适的浓度［17］。本实验通过增溶剂制备可溶且稳定的FK506滴眼液，该滴眼液pH值为7.0左右，渗透压相当于0.9%氯化钠溶液，同时加入增黏剂羧甲基纤维素纳，未加防腐剂与抗氧化剂，需4°保存，可以减少硫柳汞等防腐剂的眼表毒性［18］。通过制剂的改变，FK506和雷帕霉素滴眼液可进入眼内发挥有效的治疗作用，为寻找高效、安全的治疗葡萄膜炎方法奠定基础。

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Objective To study the effects of FK506 and Rapamycin eye drops in the treatment of endotoxin-induce uveitis in rats. Methods Twelve Sprague-Dawley（SD） rats were divided into three groups， which were 0.1% FK506 group（n=4）， 0.2% rapamycin group（n=4） and the control group（n=4）. After the injection of LPS for 24 hours， the above groups were given eye drops of 0.1%FK506， 0.2% rapamycin. The rats were observed by slit lamp microscope for 4 times per day and the symptom scores were recorded according to the methods provided by Hoekzema. Then the eyes were sampled for pathological observation.T test was used to analyze the data. Results The model of EIU in rats was successfully established. There were significant differences in the symptoms of EIU between 0.1%FK506 group and the control group， between 0.2% rapamycin group and the control group after the medication for 3-6 days（P＜0.05）. However， there were no signifi cant differences after the medication for 1-2 days（P＞0.05）. Pathological observation on the three grops showed that infl ammatory cell infi ltration in the 0.1% FK506 group and 0.2% rapamycin group alleviated. Conclusions Both 0.1% FK506 and 0.2% rapamycin eye drops can suppress the development of EIU in SD rats effectively.

FK506 Rapamycin Eye drops Uveitis

317500 浙江省温岭市第一人民医院内分泌科（赵佳佳）

100853 解放军总医院眼科（黄一飞）