房水外泌体在眼科疾病中的应用及研究进展

陶慧 苏胜 唐先玲

外泌体(exosomes)为细胞分泌的直径为30～100 nm 的脂质双分子包裹体结构，是一种重要的细胞外囊泡。研究发现，几乎所有细胞均可分泌外泌体，外泌体能够稳定存在于各种体液中。在眼部，外泌体存在于泪液、房水、玻璃体中，比较容易获得。外泌体在眼部疾病的诊断、治疗及评价药物功效方面，均显示很强的研究与应用潜力[1]。房水是眼部重要的组成部分，在人前房水中已发现了携带生物活性物质的外泌体，且房水的许多生物学功能可能与外泌体相关[2]。目前对房水外泌体的研究已逐步展开并显现出巨大的应用前景。

一、房水外泌体的生物来源及特性

Dismuke 等[2]首次证明外泌体是房水中主要的细胞外囊泡群，并且这些外泌体含有特征性 exosomal RNA(esRNA)。外泌体携带大量功能性的miRNA，少量的mRNA、lncRNA，以及特异性的蛋白质(如细胞因子、生长因子)等生物活性物质，分泌外泌体的细胞将外泌体释放于体液内并被靶细胞捕获，将携带的生物活性物质(如miRNA)递送到靶细胞中，从而实现细胞之间信息传递和功能调控[3]。已报告的外泌体功能包括调节程序性细胞死亡、促血管生成、参与炎症反应、调控肿瘤细胞与肿瘤微环境之间的信息传递[3]。

房水通过主动转运机制由睫状突毛细血管网中血浆的过滤而获得，所以房水的成分与血浆成分相似。但是，房水中的成分不完全等同于血浆，房水还有许多从眼内细胞分泌的其它生物活性物质[4]。目前的研究发现，在角膜上皮细胞[5]、小梁网细胞[6，7]、非色素睫状体上皮细胞[8]、视网膜血管周细胞[9]、视网膜血管内皮细胞[10]、Müller细胞、视网膜神经节细胞和视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium，RPE)[11]均能够分泌外泌体。另外，在眼调节过程中，悬韧带和晶状体运动会导致玻璃体液和房水混合。理论上来说，这些细胞分泌的外泌体有可能进入前房成为房水外泌体的一部分。因此，房水外泌体检测能更加特异地反应眼部疾病特征，已逐步成为眼科领域研究的热点。

二、房水外泌体的分离

房水可以使用30号针头通过前房穿刺术获得，预进行外泌体分离的房水应立即存放于-80 ℃保存直至分析。通过这种方法单眼仅能够获取100 μl左右房水，因此，如何高效、高纯度地分离房水外泌体是实现其组学分析和功能研究的前提。目前，房水外泌体主要使用连续差速离心法及外泌体分离试剂盒进行分离。

连续差速离心法是目前最常使用的方法，被认为是分离外泌体的“金标准”。Dismuke 等[2]使用连续差速离心法收集白内障手术患者房水中均质的颗粒物，通过纳米颗粒追踪技术(nanoparticletrackinganalysis,NTA)对其中的微囊泡进行检测，发现其中大多数为直径121±11 nm的微囊泡，即房水外泌体。该方法通过低速离心沉淀细胞碎片和其他大分子物质，再将上清液高速离心沉淀细胞外囊泡，此时获得外泌体可能含有污染的蛋白质等物质，需要将囊泡沉淀物重新悬浮在 PBS 中，并再次高速离心以得到纯度更高的外泌体。连续差速离心法分离外泌体的优势在于操作简便、不被分离试剂污染、应用范围广泛，但该方法分离房水外泌体有其不可避免的劣势：(1)使用设备昂贵，不易广泛推广；(2)需要样本量较大，单眼获取的房水量不能满足连续差速离心提取外泌体的需要，通常将多个房水样本混合；(3)反复离心会引起外泌体的破坏和损失[12]。数据表明，高速或低速离心步骤都不会显著影响房水外泌体的平均粒径，但是每次纯化步骤都会影响外泌体的最终产量。与原始房水样品中的外泌体总量相比，低速离心后外泌体损失60%，高速离心后，房水外泌体损失率高达 87%[2]。

近年出现了许多用于分离纯化外泌体的商品化试剂盒，如基于沉淀法原理的试剂盒、磁珠试剂盒、ELISA试剂盒、色谱法试剂盒、超滤法试剂盒等[13]。目前最常用的是由System Biosciences(SBI)根据聚合物共沉淀原理研发的ExoQuick-TC外泌体抽提试剂盒。房水样本经低速离心去除细胞和细胞碎片后，将聚合物沉淀剂 ExoQuick试剂与上清液4 ℃共孵育，使外泌体聚集。次日低速离心、PBS重悬沉淀即可获得房水外泌体[11]。试剂盒法操作简单，设备要求低，仅需进行低速离心等操作即可从少量样本中获得丰富的外泌体。但是利用此方法提取的外泌体中仍可能混有蛋白质及其他细胞外微囊泡物质，有学者证实，增加ExoQuick试剂的用量及提高离心力，可使外泌体的纯度明显提高[14]。

为了突破房水量少、外泌体得率低这一瓶颈，学者们不断探索新的分离房水外泌体的方法。Green等[15]研发了用于房水检测的简单夹心免疫荧光分析微流体装置。然而，这种基于聚二甲基硅氧烷(polydimethyl siloxane, PDMS)的微流体装置需要精密的设计和紫外遮蔽构造，因此不能被广泛推广应用。针对这一缺点，Chen等[16]研发了一种基于纤维素膜的微流体平台，它是采用微流控芯片技术的免疫亲和装置。这一装置大大降低了房水样本量(只需25 μI房水样本)，简化了从房水中分离外泌体的程序。

其他分离外泌体的方法如超滤法、蔗糖密度梯度法、免疫亲和层析法和沉淀法，由于获得的外泌体数量少，限制了在房水外泌体分离中的应用。

三、房水外泌体在眼科疾病中的应用

由于获取房水伦理因素的制约、分离高纯度房水外泌体技术的限制，房水外泌体在眼科领域的研究较少，目前主要局限于以下几种疾病的研究。

1.青光眼 青光眼是一种以进行性视网膜神经节细胞死亡、视盘萎缩和凹陷以及视野缺损为特征的疾病，是全球第二位致盲疾病。房水在青光眼的病理生理学中发挥着重要功能，许多生物活性因子、信号分子、免疫介质和类固醇激素均参与调控房水的动态循环[17]。与青光眼疾病相关的特异性房水外泌体来源是什么？目前，大多数学者认为，房水外泌体可由睫状体非色素上皮细胞释放，其内的核糖核酸片段靶向小梁网细胞调控转录和翻译[18]。此外，外泌体也可从小梁网细胞分泌[19]并返回睫状体，通过这种相互的信号转导和调控维持房水的稳态，即正常眼内压。最近的研究表明，非色素性睫状体上皮细胞来源的外泌体可以靶向小梁网细胞，通过影响 Wnt 信号传导，从而调节眼内压，其中外泌体miR-29b可通过降低Wnt/β-catenin通路水平，调控Ⅲ型胶原蛋白COL3A1等细胞外基质的功能[18]。房水外泌体中富含的肌纤维蛋白(myocilin)是由小梁网细胞以外泌体样囊泡形式释放至细胞胞外，在促进细胞碎片从小梁网排出、维持正常房水循环中发挥重要作用[19]。Myocilin的突变缺乏将导致小梁网阻塞，房水循环受阻，最终导致眼压升高[20]。

在开角型青光眼和糖皮质激素性青光眼中，房水外泌体发挥重要作用。细胞外基质的降解和重塑是维持小梁网功能的一个重要因素[7]。外泌体是细胞与细胞外基质相互作用的重要介质，在地塞米松处理的小梁网细胞释放的外泌体中，肝素/肝素硫酸结合膜联蛋白A2(heparin/heparan sulfate binding annexins A2)和A6显著减少，外泌体-纤维连接蛋白(fibronectin)结合依赖肝素硫酸盐(heparan sulfate)，导致外泌体-Fibronectin结合量显著减少。该研究结果从机制上证明了外泌体黏附物和特性的改变导致小梁网细胞外基质病理性积累，房水流出通道受阻从而导致青光眼[7]。

目前，没有特定的生物标志物可以作为早期青光眼可靠的预测指标。Tanaka等[21]通过对青光眼患者房水miRNAs的高通量分析发现，差异表达的miRNAs(如Hsa-let-7b-3p)有助于提高青光眼诊断的敏感性。外泌体在青光眼疾病中的研究已初步开展，房水外泌体及其携带的蛋白及miRNA在青光眼早期诊断、判定疾病进展、监控药物不良反应等方面具有广阔的应用前景。

2.年龄相关性黄斑变性 年龄相关性黄斑变性(aged-related macular degeneration，AMD)包括干性型AMD及湿性型AMD，是以玻璃疣及脉络膜新生血管为特征的疾病，其发病机制尚不明确[22]。目前认为，氧化应激、缺氧、慢性炎症、脂褐素的积累均是诱发AMD的病理因素。RPE对光感受器外段吞噬活性下降、细胞外基质在基底膜异常积累形成玻璃疣，继而导致神经视网膜中的感光细胞和视神经损伤而丧失视力[23]。最近，Wang 及其同事[24]描述了玻璃疣形成的新机制。他们发现玻璃疣细胞内蛋白质组图谱与外泌体的蛋白质组图谱非常相似，并证实玻璃疣的形成是由RPE细胞通过外泌体释放，将细胞内蛋白变成胞外蛋白而引发的。理论上来说，AMD患者的RPE细胞、Müller细胞或视网膜神经节细胞都有可能分泌特异性外泌体，外泌体再从玻璃体向前扩散到AMD患者的房水中。Kang 等[11]的研究结果发现，在氧化应激刺激下，ARPE-19 细胞释放的外泌体数量显著增加。而且，在房水外泌体中只检测到RPE65蛋白(RPE细胞特异性标记物)，未检测到谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS，Müller 细胞标记物)或 Thy-1蛋白(视网膜神经节细胞标记物)表达，该结果进一步证实RPE可能是AMD患者房水中特异性外泌体的主要来源。

Kang等[11]利用液相色谱与质谱技术(LC-MRM)对 AMD 患者房水外泌体进行蛋白质谱分析，结果显示组织蛋白酶 D(cathepsin D)、细胞角蛋白 8 (cytokeratin 8)、cytokeratin 14等6种标志性蛋白表达明显增加。Cathepsin D 水平升高反映了 AMD 患者可能通过自噬溶酶体途径抵抗氧化应激反应。同样，Wang 等[24]在AMD患者捐赠眼的玻璃膜疣中发现了自噬和外泌体标志物，并证实了老化的RPE细胞释放的外泌体可以通过自噬作用参与玻璃膜疣的形成。另一方面，cytokeratin 8、14在AMD患者房水外泌体中表达增高可能是自噬和氧化应激缺陷的组织学标志，也可能是导致细胞凋亡的原因[25]。但是，新生血管性 AMD 患者中细胞角蛋白的上调是机体适应性的结果，还是导致疾病进展的原因，目前还不明确。

3.糖尿病相关性白内障 糖尿病患者中白内障的患病率显著增高，虽然其临床表现与年龄相关的白内障相似，但发病机制更为复杂。在白内障手术过程中获取房水组织相对容易，近年来房水外泌体在白内障领域得到了初步的研究。Gao等[26]使用连续差速离心法分离了合并糖尿病白内障患者的房水外泌体，并将其与年龄相关性白内障患者的数据进行了比较，结果发现了大量差异表达的miRNAs(295个表达上调miRNAs和138个表达下调miRNAs)，并利用生物信息学分析了它们的相关功能，其中miR-551b表达增高并靶向αA-晶状体蛋白，调控晶状体上皮细胞的活力、增殖和凋亡，推测房水外泌体miR-551b可能参与糖尿病患者晶状体混浊发生机制。同样，在其他类型白内障中，确定房水外泌体的来源、靶组织、了解房水外泌体携带的生物活性物质(如小RNA及蛋白)的功能，将会为各种类型白内障的发病机制提供重要信息，为预防和治疗白内障提供新方向。

4.近视 近视是东南亚地区最常见的屈光异常，近视的危害性已经日益受到人们的重视，现已成为全球公共卫生问题。Chen等[27]通过房水外泌体研究筛选出15个近视特异性miRNAs和4个近视缺失性miRNAs，通过使用创新途径分析(ingenuity pathway analysis，IPA)的mir-mRNA配对工具，鉴定了可能与近视相关的六个潜在靶基因(CHRM2、CNGB3、VEGFA、ADORA2A、IGF1、LUM)，CHRM2基因可能是近视缺失has-miR-378a-5p 的靶点。这些结果表明，房水外泌体miRNAs可能在近视的发病机制中发挥重要作用。Tsai等[28]通过液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)证实，与对照组比较，近视患者房水外泌体蛋白总含量显著增加，表明近视患者房水中含有更多的外泌体蛋白。另外，转甲状腺素蛋白(transthyretin，TTR)和血色素结合蛋白(hemopexin，HPX)等25种近视特异性外泌体蛋白被证实。在以往的研究中，高度近视患者的血清中检测到高表达的TTR和HPX[29，30]。此外，在高近视患者的房水中也发现了高表达的TTR[31]。目前，近视患者房水外泌体的研究刚刚起步，还需要进一步的实验验证，以探讨近视特异性的外泌体miRNAs及蛋白在近视眼中的作用。

四、展望

目前，房水外泌体在眼科领域的研究取得了一定进展，但还处于初级阶段。在不同种类的眼部疾病中，房水外泌体及其携带的生物活性物质的来源细胞是什么，靶细胞是什么，怎样实现细胞之间信息传递和功能调控，未来的研究将不得不回答这些问题。随着对疾病认识的深入、分离房水外泌体技术的提高，房水外泌体在眼科病理生理机制研究(如细胞间通讯及调控)、诊断(如生物标志物筛选)及治疗(如药物载体研发)方面均展示了广阔的应用前景。