ICAM-3蛋白表达在预测宫颈癌放射抵抗性中的价值

沙红兰　何陈云　李　咏　刘　蓉　何爱琴⋆

ICAM-3蛋白表达在预测宫颈癌放射抵抗性中的价值

沙红兰何陈云李咏刘蓉何爱琴⋆

目的 探讨细胞间粘附分子-3（ICAM-3）、血管内皮生长因子（VEGF）的蛋白表达水平与宫颈鳞癌放射抵抗性的相关性。方法 采用免疫组织化学S-P法检测90例中晚期宫颈鳞癌患者癌组织中ICAM-3和VEGF的蛋白表达，所有患者均采用同步放化疗。其中25例为放疗后未控，65例为放疗后缓解。结果 ICAM-3在90例宫颈鳞癌组织中的阳性表达54例（60.0%）；VEGF呈阳性表达56例（62.2%）。ICAM-3在宫颈鳞癌放疗后未控组中的阳性表达率84.0%，放疗后缓解组中的阳性表达率50.8%，两组差异有统计学意义（P=0.008）；VEGF在宫颈鳞癌放疗后未控组中的阳性表达率80.0%，放疗后缓解组中的阳性表达率55.4%，两组差异有统计学意义（P=0.031）。ICAM-3和VEGF高表达均与肿瘤病理分级及淋巴结转移显著相关，而与临床分期无明显相关性。结论 ICAM-3、VEGF蛋白高表达与宫颈鳞癌放射抵抗性相关，可作为预测宫颈癌放疗敏感性的指标。

细胞间粘附分子-3 血管内皮生长因子 宫颈鳞癌 放射治疗 免疫组化

细胞间粘附因子-3（ICAM-3）即CD50，属于免疫球蛋白超家族，研究证明，ICAM-3与血液系统、淋巴系统肿瘤的发生发展相关，并参与肿瘤细胞的免疫逃脱作用［1］。本课题前期研究发现［2］在宫颈鳞癌中的表达水平明显高于宫颈上皮内瘤变（CINⅡ～Ⅲ）及正常宫颈。Young等基础研究证明［3］，ICAM-3在放射抵抗的宫颈癌细胞株SiHa/R中表达水平上调，认为ICAM-3的高表达与宫颈癌细胞株放射抵抗性有关。本文探讨ICAM-3和VEGF在预测宫颈癌放射抵抗中的价值，分析ICAM-3、VEGF高表达与病期及淋巴结转移的相关性。

1　临床资料

1.1一般资料 2010年1月至2011年12月南通大学附属肿瘤医院妇瘤科行根治性放疗后未控的存档宫颈鳞癌组织标本25例，另选同期放疗后完全缓解的宫颈鳞癌组织标本65例为对照组。所有患者取材前均未进行放疗或化疗，且临床资料完整。患者年龄43～71岁，平均年龄52.5岁。按2009年FIGO分期标准进行临床分期，Ⅱb期42例、Ⅲ期48例。影像学提示淋巴结阳性35例、阴性55例。组织病理分级：Ⅰ～Ⅱ级52例、Ⅲ级38例。所有患者均给予同步放化疗。外照射采用高能X线行前后对穿野治疗：TD 4500～5000cGy.其中全盆野剂量TD 3000cGy，四野（中间挡铅）剂量TD 1500～2000cGy，高剂量率腔内后装治疗4～5次，A点剂量700cGy/次。同步化疗采用顺铂治疗：30mg/（m2·周），4～6周。

1.2疗效判断标准 根据WHO实体瘤客观疗效评定标准，结合宫颈癌放疗后病灶的变化情况，放疗结束后3个月内原发肿瘤或部分肿瘤持续存在或盆腔内出现新的病灶为放疗后未控；完成放疗后1个月复查病灶完全消退，盆腔内未出现新的病灶为放疗后缓解。

1.3ICAM-3H和VEGF检测方法 将90例宫颈癌组织标本石蜡块连续切片，每张厚度3～4μm。1张进行HE染色病理确认，免疫组化标记用玻片均经防脱片处理。分别由两位病理科主任医师进行免疫组化读片，判定结果。兔抗人ICAM-3单克隆抗体购自R&D公司，兔抗人VEGF单克隆抗体、S-P免疫组化试剂盒购自北京中杉生物技术公司。采用S-P法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法）检测。免疫标记阳性对照组为人体脾组织，阴性对照组用PBS（磷酸盐缓冲液）替代第一抗体进行免疫标记操作。免疫组化程序严格按S-P试剂说明书进行。

1.4检测结果分析方法 ICAM-3定位于细胞膜出现棕黄色颗粒，用半定量法分析结果，判断标准如下：按染色细胞占细胞总数的比例分为5个等级：＜10%：0级；10%～25%：1级；25%～50%：2级；50%～75%：3级；＞75%：4级。根据细胞染色的强度分为4个等级：阴性：0级；淡黄色：1级；棕黄色：2级；棕褐色：3级。将染色细胞数评分与细胞染色强度评分相乘得出免疫染色评分，染色评分0分为阴性（-），1～4分为弱阳性（+），5～8分为阳性（++），9～12分为强阳性（+++）。VEGF免疫组化染色以细胞浆中出现棕黄色颗粒为其阳性判定标准。判断标准如下：阳性细胞数＜1%为（-），阳性细胞数1%～10%为（+），阳性细胞数11%～50%为（++），阳性细胞数＞51%为（+++）。

1.5统计学方法 采用SPSS 11.0统计软件。各组间率的比较采用χ2检验，相关性分析用Spearman等级相关分析法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1ICAM-3在放疗未控组和缓解组中的表达情况 ICAM-3阳性表达主要位于癌细胞的细胞膜，阳性和阴性表达见图1、2。90例宫颈鳞癌组织中的ICAM-3阳性表达54例。ICAM-3在放疗后未控组中有21例呈阳性表达，阳性表达率84.0%。在放疗后缓解组中有33例呈阳性表达，阳性表达率50.8%，两组比较差异有统计学意义（χ2=6.98，P=0.008）。见表1。

图1　宫颈鳞癌 ICAM-3（+）（×200）

图2　宫颈鳞癌ICAM-3（+++）（×200）

表1　ICAM-3在宫颈鳞癌放疗后未控组和缓解组中的表达（n）

2.2VEGF的表达结果 VEGF在宫颈癌组织中的表达主要位于肿瘤组织的细胞浆，呈弥漫性或散在分布的棕褐色颗粒，其阳性和阴性表达见图3、4。90例宫颈癌中，VEGF呈高表达56例。VEGF在放疗后未控组25例中有20例呈阳性表达，阳性表达率80.0%。在放疗后缓解组中有36例呈阳性表达，阳性表达率55.4%，两组比较差异有统计学意义（χ2=4.65，P=0.031）。见表2。

图3　宫颈癌VEGF表达（-）（×400）

图4　宫颈癌VEGF表达（++）（×400）

表2　VEGF在宫颈鳞癌放疗后未控组和缓解组中的表达（n）

2.3CIAM-3、VEGF表达与临床特征的相关性 见表3。

表3　ICAM-3、VEGF在不同病期、分级及淋巴结转移中的表达［n（%）］

3　讨论

宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤，临床上＞70%宫颈癌患者需接受放射治疗。关于宫颈癌放射治疗敏感性的影响因素已逐渐受到关注。国内外较多学者研究肿瘤放疗敏感相关因子，但迄今为止，在预测宫颈癌放射敏感性方面的研究尚不充分。

细胞间粘附分子（ICAMs）指一类调节细胞与细胞间、细胞与细胞外基质间相互结合和起粘附作用的膜表面糖蛋白，目前发现有3种：ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3。本课题前期研究发现［2］，ICAM-3在CINⅢ和宫颈癌组织中高表达，而在正常宫颈组织中低表达，提示其表达水平与宫颈癌的发生发展相关。本课题组前期采用PCR技术已证明ICAM-1的高表达与宫颈癌的放射抵抗相关［4］。有研究发现ICAM-3可与LFA-1结合通过分子结构而调节ICAM-1（CD54）/LFA-1的相互作用［5］。因此推测ICAM-3高表达与宫颈癌的放射抵抗相关。本资料显示ICAM-3在放疗后未控组中的表达高于缓解组，提示ICAM-3高表达与宫颈癌的放射抵抗有关。可能的机制是ICAM-3可能参与或调节VEGF的FAK信号途径，FAK已被证实会诱导抑制辐射后的细胞凋亡［6-7］，从而引起宫颈癌放射抵抗性增加。因此临床上在治疗前通过检测ICAM-3表达水平，预测宫颈癌的放疗敏感性，进一步判断预后和指导治疗方案的制定。

Bachtiary B［8］等研究发现，宫颈癌患者放疗前VEGF水平高者，放疗后的近期肿瘤缓解率和远期疗效均相对较差。本资料结果显示，VEGF在放疗后未控组中的表达高于缓解组，差异有统计学意义（P＜0.05），与前述研究结果一致。VEGF引起肿瘤细胞放射抵抗的机制可能是：（1）放射治疗通过激活EGFR而激活P13K/Akt通路，刺激VEGF受体高表达，进而诱导肿瘤新生血管的形成，促进肿瘤侵袭和转移［9］。（2）缺氧可上调VEGF基因的表达，引起肿瘤自身侵袭性增加和对放化疗的抗拒性增加［10］。

本资料结果提示ICAM-1和VEGF高表达与宫颈癌的病理分级和淋巴转移相关。研究表明［11］，ICAM-3表达于血管及淋巴管内皮细胞，通过与细胞浆内酪氨酸磷酸化的小分子β-catenin结合，调节内皮细胞的增殖和血管新生，另外ICAM-1、ICAM-3等细胞粘附因子可能作为信号传导分子调节内皮细胞间以及内皮细胞与细胞外基质间的粘附和去粘附，促进血管和淋巴管的增生，在肿瘤的浸润和淋巴结转移中发挥着重要作用。血管内皮生长因子（VEGF），是目前公认一种重要的促血管生成因子，研究发现［12］，VEGF通过选择性与内皮细胞上的受体结合，使细胞内的Ca2+水平迅速升高，通过磷酸肌醇特异性磷酸脂酶C途径，使细胞内肌醇三磷酸水平升高，转导细胞内信号，从而使血管内皮细胞分裂增殖、促进血管生长和提高血管通透性，利于恶性肿瘤的侵袭和转移。而和临床分期无关。由于本资料选择的是适合放疗的Ⅱb～Ⅲ期宫颈鳞癌患者，结果可能未能反映所有临床分期，还需进一步进行全面分期的研究。

［1］ 陈玲，于桂兰，李元堂，等.ICAM-3在急性白血病中的作用.山东大学学报，2008，（6）:608-611.

［2］ 李咏，何爱琴.ICAM-3蛋白表达在宫颈鳞癌组织中的表达及临床意义，中国妇幼保健，2013，28（29）:4873-4875.

［3］ Young Min Chung， Byoung-Gie Kim， Chang-Soo Park. Increased expression of ICAM-3 is associated with radiation resistance in cervical cancer. Cancer， 2005，117:194-201.

［4］ 何爱琴.宫颈癌组织ICAM-1和VEGF表达与放疗敏感性的研究.中华肿瘤防治杂志，2014，21（4）:284-288.

［5］ Kobayashi R，Tawa A，Hanada R，et al.Extramedullary infiltration at diagnosis and prognosis in children with acute myelogenous leukemia.Pediatr Blood Cancer，2007，48（4）:393-398.

［6］ Kasahara T， Koguchi E， Funakoshi M， et al.Antiapoptotic action of focal adhesion kinase （FAK） against ionizing radiation. Antioxid Redox Signal，2002，4:491-499.

［7］ Moon HS， Park WI， Choi EA， et al.The expression and tyrosine phosphorylation of E-cadherin/catenin adhesion complex，and focal adhesion kinase in invasive cervical carcinomas. Int J Gynecol Cancer， 2003，13:640-646.

［8］ Bachtiary B， Selzer E， Knocke TH， et al. Serum VEGF levels in patients undergoing primary radiotherapy for cevical cancer impact on progression-free survival. Cancer Lett， 2002， 179（2）:197-203.

［9］ Prenzel N，FishcherOM，Streit S，et al.The epidermal growth factor receptor family as a central element for cellular signal transduction and diversification.Endocr Relat Cancer，2001，8（1）:11-31.

［10］ Kaluz S， Kaluzova M， Stanbridge EJ.Regulation of gene expression by hypoxia:integration of the HIF-transduced hypoxicsignal at the hypoxiaresponsive element.Clin Chim Acta ， 2008， 395（1-2）: 6-13.

［11］ 张文彩，谭玉珍.血小板内皮粘附因子1、血小板内皮粘附因子3和CD44在体外淋巴管新生中的作用.解剖学报，2005，36（1）:94-98.

［12］ 李夏芳.VEGF及其受体与卵巢癌关系的研究进展.赣南医学院学报，2012，32（4）:633-635.

Objective To study the relationship between Intercellular Adhesion Molecule-3、Vascular endothelial growth factor With radioresistance of human cervical squamous cancer. Methods S-P immunohistochemical method was performed to detect the expression of ICAM-3 and VEGF in 90 patients with advanced cervical squamous cell carcinoma，of which 25 cases were non-well treated after radiotherapy，65 cases were well treated after radiotherapy. Result The positive expression level of ICAM-3 and VEGF were related to clinical stage and lymph nodes metastasis；The expression level of ICAM-3 in non-well treated group was higher than that in well treated group（84.0% vs 50.8%，P=0.008）. The expression level of VEGF in non-well treated group was higher than that in well treated group（80.0% vs 55.4%，P=0.031）. The expression of ICAM-3 and VEGF were signifi cantly related to lymph node metastasis and grade of differentiation，but no relation to clinicai stage. Conclusion The expressions of ICAM-3 and VEGF are related to radioresistance of cervical squamous cell carcinoma.

ICAM-3 VEGF cervical squamous cell carcinoma radiotherapy immunohistochemistry

江苏省南通市卫生科技计划项目（20112KX11008）

226500 江苏省如皋市人民医院（沙红兰）

226361 南通大学附属肿瘤医院（何陈云 李咏 刘蓉何爱琴）