miRNA-146a对寻常性银屑病患者外周血CD4+T细胞的调控研究

魏明 梁颖红 涂玲 刘佳 龚艳杰 张宜花 杨璐

450052郑州大学第五附属医院检验科

miRNA-146a对寻常性银屑病患者外周血CD4+T细胞的调控研究

魏明 梁颖红 涂玲 刘佳 龚艳杰 张宜花 杨璐

450052郑州大学第五附属医院检验科

目的 研究miRNA-146a对寻常性银屑病患者外周血CD4+T淋巴细胞的调控，探讨miRNA-146a在寻常性银屑病发病中的作用。方法 收集寻常性银屑病患者和健康对照各30例。采用实时定量PCR检测外周血CD4+T淋巴细胞miRNA-146a表达水平，ELISA检测血浆干扰素（IFN）-γ、白细胞介素（IL）-4表达水平。免疫磁珠法分选外周血CD4+T淋巴细胞，将分离的细胞分为对照组、miRNA-146a组和miRNA-146a抑制物组，分别转染阴性对照miRNA、miRNA-146a模拟物和miRNA-146a抑制物后进行细胞培养，流式细胞仪检测Th1和Th2细胞数量，蛋白免疫印迹法和实时定量PCR分别检测IFN-γ受体α（IFN-γRα）、T细胞表达T盒（T-bet）、GATA-3蛋白和mRNA的表达，ELISA检测细胞培养液上清液IFN-γ、IL-4水平。结果 寻常性银屑病患者外周血CD4+T淋巴细胞miRNA-146a［（243.81±94.32）%］与血浆IFN-γ水平［（27.69±7.64）ng/L］较健康对照组［分别为（105.74±22.93）%和（9.75±2.81）ng/L］升高，差异均有统计学意义（t值分别为 6.653和 4.237，均P＜0.01），且miRNA-146a的表达与血清IFN-γ呈正相关（r=0.837，P＜0.01）。体外CD4+T淋巴细胞培养结果显示，与对照组比较，miRNA-146a组Th1数量、T-bet蛋白和mRNA表达、培养上清液IFN-γ水平均显著增加，IFN-γRα蛋白表达降低，差异均有统计学意义（均P＜0.01）；但是，与对照组比较，miRNA-146a组和miRNA-146a抑制物组Th2细胞数量、GATA-3蛋白、GATA-3 mRNA表达以及上清液中IL-4水平差异无统计学意义（均P＞0.05）。结论 miRNA-146a可能通过影响Th1细胞的分化和功能参与对寻常性银屑病患者外周血CD4+T淋巴细胞的调控，在银屑病发病过程中发挥一定的作用。

银屑病；RNA；T淋巴细胞，辅助诱导；干扰素γ；白细胞介素4；微RNAs

银屑病是一种多基因遗传背景下由T淋巴细胞介导的慢性炎症性皮肤病，CD4+T细胞及多种细胞因子在银屑病的发病中起重要作用［1］。微小RNA（micro-RNA，miRNA）是一类高度保守的非编码小分子单链RNA，参与调控细胞生长、发育、分化和增殖等多个生命过程［2］，参与免疫细胞分化和成熟、抗体产生、炎性因子释放等免疫过程，对机体免疫功能的正常发挥起非常重要的作用［3］。研究表明，miRNA-146a可影响CD4+T淋巴细胞亚群分化、增殖和活化的过程［4-5］，但miRNA-146a在寻常性银屑病中的表达对CD4+T细胞是否有作用尚不清楚。我们通过研究miRNA-146a对寻常性银屑病患者外周血CD4+T淋巴细胞亚群的调控，探讨miRNA-146a在银屑病发病中的作用。

材料与方法

1.研究对象：2011年10月7日至2014年12月25日就诊于郑州大学第五附属医院皮肤性病科门诊的寻常性银屑病患者30例，采用银屑病面积和严重程度指数（psoriasis area and severity index，PASI）［6］对病情进行评分，其中男 18 例，女 12 例，平均年龄18.60岁，病程1个月至30年，平均7.1年，PASI评分1.8～50.0分，平均14.36分。患者近4周内未接受糖皮质激素或免疫抑制剂等系统治疗，未合并其他皮肤病及自身免疫性疾病、心血管疾病、神经系统疾病、内分泌系统疾病、呼吸系统疾病、肝病或肿瘤等。健康对照组30例，其中男11例，女9例，平均年龄18.46岁。两组性别构成、年龄差异均无统计学意义（均P＞0.05）。本研究获医院伦理委员会批准，所有病例选择和标本提取均获患者知情同意并签署同意书。

2.标本采集：取肝素抗凝外周静脉血10 ml用于ELISA检测和CD4+T淋巴细胞分离；取其中9例患者外周血分离的CD4+T淋巴细胞用于体外培养干预实验。本试验遵照郑州大学医学伦理委员会人体试验管理规范执行。

3.主要试剂与仪器：改良型RPMI 1640培养基（美国Hyclone公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），人淋巴细胞分离液（北京索莱宝科技有限公司），Trizol试剂（北京天根生化科技有限公司），藻红蛋白（P-phycoerythrin）-青色素（cyanine）染料 5（PE-Cy5）标记小鼠抗人 CD4 单克隆抗体、异硫氰酸荧光素（FITC）标记小鼠抗人IFN-γ单克隆抗体、藻红蛋白（PE）标记小鼠抗人IL-4单克隆抗体（美国Biolegend公司），佛波酯、离子霉素、莫能星（monensin）（美国 Sigma公司），破膜剂（美国BD公司），人CD4+T细胞分选试剂盒（挪威Dynal公司），干扰素（IFN）-γ受体 α（IFN-γRα）、T细胞表达 T 盒（T-box expressed in T cells，T-bet）、GATA 结合蛋白 3（GATA-binding protein 3，GATA-3）、β 肌动蛋白多克隆抗体（美国Proteintech Group公司），人IFN-γ、IL-4 ELISA定量检测试剂盒（美国R&D公司），实时定量PCR试剂盒（美国GeneCopeia公司），Epics XL型流式细胞仪（美国Beckman-Coulter公司），垂直电泳仪、电泳槽、蛋白电泳转膜装置、GelDoc 2000型凝胶成像分析系统（美国Bio-Rad公司）。

4.细胞分离、培养及体外转染：采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离外周血单个核细胞。免疫磁珠法进一步从单个核细胞中分离CD4+T淋巴细胞，流式细胞仪检测细胞的纯度，0.2%台盼蓝鉴定活细胞数。将分离获取的细胞调整为2×106/ml，并分为对照组（转染50 nmol/L阴性对照miRNA）、miRNA-146a组（转染50 nmol/L miRNA-146a模拟物）和miRNA-146a抑制物组（转染50 nmol/L miRNA-146a 抑制物）。阴性对照 miRNA、5′-miRNA-146a模拟物与miRNA-146a抑制物的序列分别为 5′-CGCGAGAAGAUGACCCAGAU-3′、5′-UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGUCCCUAUCACG AUUAGCAUUAAUU-3′和 5′-ACCCCUAUCACGAU UAGCAUUAA-3′。用脂质体2000进行转染，转染过程严格按操作说明进行。转染5 h后，用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素、2 mmol/L谷氨酰胺的RPMI 1640培养基，于37℃、5%CO2培养箱中培养24 h，取少量细胞悬液涂布于载玻片上，倒置相差荧光显微镜下观察，转染成功的细胞发出绿光。计算转染率，转染率=发出绿色荧光的细胞数/可见光下总细胞数×100%，48 h后，细胞计数，收集细胞。

5.流式细胞仪检测Th1和Th2细胞：取2.0×105/ml CD4+T淋巴细胞，加含10%胎牛血清的RPMI 1640 培养基，加入佛波酯（25 μg/L）、离子霉素（1 mg/L）、莫能星（1.7 mg/L），孵育 5 h，离心后加破膜剂500 μl，破膜 10 min后分别加 PE-CY5-CD4，PE-IL-4和FITC-IFN-γ单抗，对照管加同型对照抗体，室温下孵育15 min，上机行流式细胞仪检测。

6.ELISA检测IFN-γ、IL-4水平：将全血以850×g离心15 min后取血浆，放置在-80℃冰箱中备用，集中检测。取2×106/ml转染后的CD4+T淋巴细胞和对照组CD4+T淋巴细胞分别加入5 μg/L的植物凝血素，于37℃、5%CO2培养箱中培养刺激48 h后收集上清液。采用ELISA法检测血浆和上清液IFN-γ、IL-4的表达水平，操作按说明书进行。

7.蛋白免疫印迹法检测 T-bet、GATA-3、IFN-γRα蛋白的表达：在植物凝血素刺激后收集细胞，用蛋白裂解液提取细胞总蛋白，Bradford法测定蛋白浓度。取蛋白样品于10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，将蛋白转至聚偏氟乙烯膜上。室温下封闭1 h，加入兔抗人T-bet多克隆抗体（1∶500），兔抗人GATA-3多克隆抗体（1∶500），兔抗人IFN-γRα 多克隆抗体（1∶500）室温孵育 2 h，以小鼠抗人β肌动蛋白单克隆抗体（1∶2 000）作为内参。漂洗后加相应二抗孵育1 h，加入ECL发光剂，曝光，显影并定影。用Quantity One软件分析目标条带的灰度值，以目标条带灰度值与内参条带灰度值的比值作为目的蛋白的相对表达量。

8.实时定量 PCR 检测 miRNA-146a、T-bet、GATA-3和IFN-γRα mRNA的表达：体外培养细胞在植物凝血素刺激后，用Trizol提取总RNA，反转录合成cDNA，建立PCR反应体系。miRNA-146a及内参照U6引物由美国GeneCopeia公司提供（miRNA-146a扩增应用miScript通用引物及其特异性引物，分别为：5′-UGAGAACU GAAUUCCAUGGGUU-3′和 U6：5′-CTCGCTTCGGCAG CAGC ACA-3′）。 T-bet、GATA-3、IFN-γRα及β肌动蛋白引物［生工生物工程（上海）有限公司合成］见表1。PCR反应步骤如下：95℃变性10min；40个循环（95 ℃，10 s；退火，20 s；72 ℃，31 s）。miRNA-146a的 PCR反应退火温度为 60℃，T-bet、GATA-3、IFN-γRα的PCR反应退火温度均为58℃。扩增反应结束后，从72℃缓慢加热到95℃，以建立PCR产物的熔解曲线。每个标本均设置2个复管行PCR反应。根据各基因实时扩增曲线和熔解曲线，取Ct值，按 2-△△Ct法计算待测目的基因相对表达量，2-△△Ct值相差3倍认为表达有差异［7］。

9.统计学方法：应用SPSS 13.0统计软件对数据进行统计学分析。计量数据以±s表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析并进行多重比较，相关性采用直线相关分析。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

结 果

1.外周血CD4+T淋巴细胞miRNA-146a的表达：寻常性银屑病患者组miRNA-146a的表达（243.81%±94.32%）高于健康对照组（105.74%±22.93%），两组差异有统计学意义（t=6.653，P＜0.01）。

2.血浆IFN-γ、IL-4水平：寻常性银屑病组患者血浆 IFN-γ水平［（27.69±7.64）ng/L］显著高于健康对照组［（9.75± 2.81）ng/L］，两组差异有统计学意义（t=4.237，P＜0.01）；两组 IL-4水平分别为（12.65±2.17）ng/L和（11.38±2.23）ng/L，差异无统计学意义（t=0.037，P＞0.05）。患者组外周血CD4+T淋巴细胞miRNA-146a表达与IFN-γ水平呈正相关（r=0.837，P＜0.01），与 IL-4水平无相关关系（r=0.004，P＞ 0.05）。

表1 引物序列

表2 体外培养银屑病患者外周血单个核细胞中干扰素γ（INF-γ）+CD4+T细胞和白细胞介素4（IL-4）+CD4+T细胞比例以及培养上清液INF-γ、IL-4水平（±s）

表2 体外培养银屑病患者外周血单个核细胞中干扰素γ（INF-γ）+CD4+T细胞和白细胞介素4（IL-4）+CD4+T细胞比例以及培养上清液INF-γ、IL-4水平（±s）

注：a：与对照组比较，P ＜ 0.01；b：与 miRNA-146a组比较，P ＜ 0.01

处理组例数IFN-γ+（%)IL-4+（%)IFN-γ（ng/L)IL-4（ng/L)对照组 9 19.28±2.41 2.08±0.32 32.33±4.22 9.11±1.15 miRNA-146a组 9 33.12±2.87a 2.16±0.30 54.69±6.26a 8.59±1.13 miRNA-146a抑制物组 9 24.45±3.31b 2.11±0.31 43.14±5.73b 8.87±1.14 F值 55.367 0.481 45.638 0.376 P值 ＜0.01 0.612 ＜0.01 0.679

3.体外CD4+T淋巴细胞培养后Th1和Th2细胞变化：miRNA-146a组Th1细胞比例显著高于对照组和miRNA-146a抑制物组（均P＜0.01）。3组间Th2细胞比例差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

4.体外细胞培养上清液IFN-γ、IL-4水平：miRNA-146a组IFN-γ水平显著高于对照组和miRNA-146a抑制物组（均P＜0.01）。3组间IL-4水平差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

5.IFN-γRα、T-bet、GATA-3 蛋白表达 ：miRNA-146a组IFN-γRα蛋白表达显著低于对照组和miRNA-146a抑制物组，T-bet蛋白表达显著高于后两组，差异均有统计学意义（P＜0.01）。3组间GATA-3蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）。患者组IFN-γRα蛋白表达与IFN-γ水平呈显著负相关（r=-0.753，P＜0.01），与IL-4表达无明显相关性（r=0.038，P＞0.05）。见表3，图1。

表3 体外培养银屑病患者外周血单个核细胞中CD4+T细胞中干扰素γ受体α（IFN-γRα）、T-bet、GATA3蛋白及 mRNA 表达（±s）

表3 体外培养银屑病患者外周血单个核细胞中CD4+T细胞中干扰素γ受体α（IFN-γRα）、T-bet、GATA3蛋白及 mRNA 表达（±s）

注：IFN-γRα：IFN-γ 受体 α；T-bet：T 细胞表达 T 盒；GATA-3:鸟嘌呤腺嘌呤胸腺嘧啶腺嘌呤序列结合蛋白-3。a：与对照组比较，P ＜ 0.01；b：与miRNA-146a组比较，P＜0.01

处理组 例数对照组 9 0.95±0.09 0.75±0.06 0.57±0.06 1.01±0.16 1.04±0.15 1.03±0.31 miRNA-146a组 9 0.41±0.06a 0.76±0.07 1.21±0.11a 1.12±0.17 1.14±0.16 2.26±0.68a miRNA-146a抑制物组 9 0.62±0.06b 0.77±0.07 0.89±0.07b 1.08±0.16 1.12±0.15 1.69±0.67b F值 143.217 0.086 152.353 1.024 1.536 12.753 P值 ＜0.01 0.901 ＜0.01 0.351 0.231 ＜0.01 IFN-γRα蛋白 GATA3蛋白 T-bet蛋白 IFN-γRα mRNA GATA3 mRNA T-bet mRNA

图1 银屑病患者外周血CD4+T淋巴细胞干扰素γ受体α（IFN-γRα）、T-bet、GATA-3 蛋白的表达 1：对照组；2：miRNA-146a组；3：miRNA-146a抑制物组

6. 体外培养细胞IFN-γRα、T-bet，GATA3mRNA表达变化：miRNA-146a组 T-bet mRNA表达水平显著高于对照组和miRNA-146a抑制物组 （均P＜ 0.01）；3 组间 IFN-γRα、GATA-3 mRNA表达差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

讨 论

miRNA存在于基因组的非编码区，通过靶mRNA靶位点与3′端非翻译区的碱基配对，参与转录后调控，调节细胞增殖、分化、凋亡的生物学过程［8-9］。Zibert等［10］发现，丹麦寻常性银屑病患者皮损和未受累健康皮肤组织中miRNAs的表达具有差异性。Sonkoly等［11］采用实时定量PCR方法对银屑病患者和健康人体不同组织中miRNA-146a等表达谱进行分析比较，结果显示，miRNA-146a在银屑病皮损中表达量较健康人皮肤明显增加。Koga等［12］研究结果显示，银屑病患者外周血单个核细胞中miRNA-146a量也升高，上调的miRNA-146a可能通过对T细胞的调节作用抑制过度的慢性炎症反应。miRNA-146a作为一个负调控分子，可通过互补结合于白细胞介素-1受体相关激酶1（IRAK1）和肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）的3′端非翻译区，在转录后水平抑制TRAF6和IRAK1的表达［13-14］，从而对天然免疫应答中细胞内信号转导起一种负反馈调节作用［15］，提示寻常性银屑病患者miRNA-146a表达升高可能损伤了机体的天然免疫，在寻常性银屑病的发病过程中发挥一定的作用。

越来越多的研究表明，miRNA参与了CD4+T淋巴细胞活化的过程，抗CD3抗体刺激活化的T淋巴细胞可导致多种 miRNA 表达的改变［16］。Guo 等［17］研究表明，miRNA-146a可导致Th1/Th2亚群失衡从而参与急性冠脉综合征的发病过程。本研究结果显示，miRNA-146a在寻常性银屑病患者的CD4+T淋巴细胞表达明显上调，且和细胞因子IFN-γ表达水平呈正相关，提示miR-146a参与寻常性银屑病患者CD4+T淋巴细胞的调控，可能影响Th1细胞的分化和功能。进一步体外细胞培养结果显示，miRNA-146a干预可以明显增加Th1细胞主要转录因子T-bet蛋白和mRNA表达，主要的细胞因子IFN-γ表达也明显增加。提示miRNA-146a可能通过复杂的调控网络对细胞信号转导通路进行调控，影响T-bet及效应因子IFN-γ的表达。而IFN-γRα的mRNA表达无明显改变，蛋白表达降低。表明IFN-γRα可能是miRNA-146a的直接靶基因，通过IFN-γRα介导的IFN-γ刺激信号在Th1细胞的分化过程中起重要作用。推测miRNA-146a促进Th1细胞分化的作用可能与下调IFN-γRα的蛋白表达有关。

但在本研究中，寻常性银屑病患者体外培养CD4+T淋巴细胞给予miRNA-146a干预后，Th2细胞数量及活化均无明显改变。其原因可能与疾病过程中细胞的状态及诱导分化的条件有关，且miRNA对基因调控途径是一个复杂的网络，其可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过多个miRNA的共同作用来精细调控某个基因的表达［18］。因此，可能有多个miRNA共同参与寻常性银屑病患者CD4+T淋巴细胞分化及活化相关靶基因的调控，最终的调控效应表现为对Th2的分化和功能无明显影响，但miRNA对Th2作用有待进一步探讨。

综上所述，寻常性银屑病患者外周血CD4+T淋巴细胞miRNA-146a的表达增加，可通过调控CD4+T淋巴细胞使其偏向Th1细胞分化，导致Th1/Th2的失衡，同时可活化和增强Th1的功能，主要炎症细胞因子分泌增加，继而导致寻常性银屑病免疫调控功能紊乱。因此，CD4+T淋巴细胞miRNA-146a的表达增加在寻常性银屑病的发生过程中具有重要的作用，但miRNA-146a在寻常性银屑病中的具体作用机制尚待进一步研究。

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Regulatory effects of miRNA-146a on peripheral blood CD4+T lymphocytes from patients with psoriasis vulgaris

Wei Ming,Liang Yinghong,Tu Ling,Liu Jia,Gong Yanjie,Zhang Yihua,Yang Lu
Clinical Laboratory,Fifth Affiliated Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou 450052,China

ObjectiveTo evaluate regulatory effects of miRNA-146a on peripheral blood CD4+T lymphocytes from patients with psoriasis vulgaris,and to investigate the role of miRNA-146a in the pathogenesis of psoriasis vulgaris.MethodsTotally,30 patients with psoriasis vulgaris and 30 healthy human controls were enrolled into this study.Venous blood samples were obtained from these subjects,and CD4+T lymphocytes were isolated from these samples by using magnetic activated cell sorting （MACS）.Real-time quantitative PCR （RT-PCR）was performed to measure the expression of miRNA-146a in peripheral blood CD4+T lymphocytes,and enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）to determine plasma levels of interferon-γ（IFN-γ）and interleukin 4（IL-4）.Some CD4+T lymphocytes were divided into 3 groups to be transfected with 50 nmol/L negative control miRNA （control group）,miRNA-146a mimics（miRNA-146a group）or miRNA-146a inhibitor （miRNA-146a inhibitor group）.After 24-hour additional culture,flow cytometry was conducted to determine the number of Th1 and Th2 cells,Western-blot analysis and RT-PCR were performed to measure the protein and mRNA expressions of IFN-γ receptor α （IFN-γRα）,T-box expressed in T cells （T-bet）and GATA-binding protein-3 （GATA-3）respectively,and ELISA was carried out to determine the levels of IFN-γ and IL-4 in supernatants of CD4+T lymphocytes.ResultsCompared with the healthy control group,the patient group showed significantly increased miRNA-146a expression in peripheral blood CD4+T lymphocytes（243.81% ±94.32%vs.105.74%±22.93%,t=6.653,P＜0.01）and plasma IFN-γ level（27.69±7.64 ng/L vs.9.75±2.81 ng/L,t=4.237,P＜0.01）.Moreover,miRNA-146a expression was positively correlated with plasma IFN-γ level in the patients（r=0.837,P＜0.01）.After 24-hour culturein vitro,there was a significant increase in the number of Th1 cells,protein and mRNA expressions of T-bet,and supernatant level of IFN-γ,but a significant decrease in the protein expression of IFN-γRα in the miRNA-146a group compared with the control group（all P＜0.01）.However,no significant differences were observed in the number of Th2 cells,mRNA or protein expressions of GATA-3,or supernatant level of IL-4 among the control group,miRNA-146a group and miRNA-146a inhibitor group （allP＞0.05）.ConclusionmiRNA-146a may play an important role in the pathogenesis of psoriasis vulgaris by participating in the regulation of peripheral blood CD4+T lymphocytes via affecting Th1 cell differentiation and function.

Psoriasis;RNA;T-lymphocytes,helper-inducer;Interferon-gamma;Interleukin-4;MicroRNAs

Wei Ming,Email:gushiweiming@126.com

魏明，Email：gushiweiming@126.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2016.04.004

2015-08-04）

（本文编辑：尚淑贤）