Wnt10b诱导再生毛囊的表达特性研究

星懿展 郭海英 马小艮 李玉红

400038重庆，第三军医大学基础部细胞生物学教研室

Wnt10b诱导再生毛囊的表达特性研究

星懿展 郭海英 马小艮 李玉红

400038重庆，第三军医大学基础部细胞生物学教研室

目的 研究Wnt10b诱导再生毛囊的表达特性及诱导作用机制。方法 HEK-293细胞内扩增并用氯化铯梯度离心纯化Wnt10b过表达腺病毒及对照腺病毒，皮内注射至C57BL/6J小鼠背部皮肤，在处理后2.5、5、7、9、14、28 d时取材，HE染色及免疫组化染色观察毛囊结构特征、信号通路表达特征及增殖特性。结果HE染色发现，AdWnt10b处理组从第5天开始出现新生毛囊结构，正常生长，第28天左右进入退化期。免疫组化染色发现，AdWnt10b处理组从处理后5 d开始新生毛囊具有AE15表达，随着毛囊生长而增加，至处理后28 d开始减少。在AdWnt10b处理后5 d，观察到β连环素的核表达，Lef1特异性表达于毛芽和毛母质部位，且全为核表达。在AdWnt10b处理后28 d，Lef1表达减弱。AdWnt10b处理后2.5 d即可见Ki67表达于表皮和毛囊外根鞘。处理后2.5、7、9、14 d均在隆突区见到Ki67的表达；从处理后7 d开始，Ki67表达于毛母质细胞。结论Wnt10b诱导的再生毛囊具有正常的毛囊结构，Wnt10b激活了经典Wnt信号通路，其作用的靶细胞是毛囊干细胞及其子代细胞。

毛囊；再生；干细胞；Wnt信号通路；Ki-67抗原；β连环素

毛囊的周期性生长受到多种信号通路的调控，包括无翅型小鼠腺癌病毒整合位点（wingless-type mouse mammary tumor virus integration site，Wnt）信号通路、骨形成蛋白信号通路、成纤维细胞生长因子信号通路等。Wnt蛋白家族是一系列高度保守的分泌性糖蛋白，它们通过自分泌或旁分泌形式发挥作用［1］。Ouji等［2］研究发现，Wnt10b 能够促进培养的触须毛囊的生长。我们前期通过在体和离体实验研究发现，过表达腺病毒介导的Wnt10b能够诱导毛囊的周期性再生，Wnt10b可能通过经典Wnt信号通路发挥这种诱导作用［3-4］。本文在前期研究的基础上，对Wnt10b诱导的毛囊的表达特征进行深入研究，以期阐明Wnt10b在毛囊周期中的作用机制，并为开发治疗毛囊周期相关疾病的药物提供理论基础。

材料和方法

一、腺病毒扩增与纯化

腺病毒介导的Wnt10b（adenovirus-mediated Wnt10b，AdWnt10b）及腺病毒介导的绿色荧光蛋白（adenovirus-mediated green fluorescentprotein，AdGFP）由美国芝加哥大学何通川教授惠赠，病毒扩增与纯化按文献［5］方法进行。

二、动物处理与分组

36只雄性7～8周龄C57 BL/6J小鼠（雄性小鼠毛囊周期更为稳定）购自第三军医大学实验动物中心，合格证号SCXK（军）20120011，并在实验动物中心按SPF级饲养和实验。将36只小鼠随机分为对照组和实验组，每组又随机分为6小组，即2.5、5、7、9、14、28 d组，每小组3只。腹腔注射1%戊巴比妥100 μl麻醉小鼠；沿背部正中线，经皮内注射25 μl单剂量（108pfu/ml）AdWnt10b（AdWnt10b处理组）或AdGFP（AdGFP 处理组）；于处理后 2.5、5、7、9、14、28 d，分别在注射部位取材，进行HE染色及免疫组化染色。免疫组化所用一抗及稀释度如下：AE15（美国纽约大学孙同天教授惠赠，1∶4），β连环素（美国Santa Cruz公司，1∶100），Ki67（美国 Santa Cruz公司，1 ∶100），淋巴增强因子 1（lymphoid enhancer binding factor1，Lef1）（美国 SantaCruz公司，1 ∶100）。

结 果

一、AdWnt10b诱导再生毛囊的结构特征

HE染色发现，AdWnt10b处理组，从第5天开始出现新生毛囊结构，新生毛囊正常生长，在第28天左右进入退化期，说明再生毛囊具有毛囊周期性生长的特征。AdGFP处理组（空载体对照）在观察期间一直处于静止期，和周边未注射部位没有明显差异。除毛囊结构变化外，AdWnt10b处理组可见表皮增厚。见图1。

免疫组化染色发现，AdWnt10b诱导再生的毛囊具有AE15表达，这种表达从处理后5 d开始出现，随着毛囊生长而增加，至处理后28 d开始减少。AdGFP处理组一直未观察到AE15表达。见图2。

二、Wnt10b诱导再生毛囊的信号通路表达特征

免疫组化染色发现，β连环素在AdWnt10b处理组和AdGFP处理组均有表达，但AdWnt10b处理组较强。而且，在AdWnt10b处理后5 d，观察到β连环素的核表达。见图2。

AdWnt10b处理后5 d起可以观察到Lef1特异性表达于毛芽和毛母质部位，且全为核表达。在AdWnt10b处理后28 d，Lef1表达减弱。AdGFP处理组一直未观察到Lef1的表达，符合静止期的表达特征。见图2。

图1 HE染色观察腺病毒介导的Wnt10b（AdWnt10b）和腺病毒介导的绿色荧光蛋白（AdGFP）诱导不同时间后再生毛囊的结构（×400）1A：AdWnt10b处理的皮肤；1B：AdGFP处理的皮肤

图2 免疫组化染色观察腺病毒介导的Wnt10b（AdWnt10b）和腺病毒介导的绿色荧光蛋白（AdGFP）诱导不同时间后再生毛囊中AE15、β连环素、Lef1、Ki67的表达（×400） AE15表达于毛囊的内根鞘部位；β连环素在AdWnt10b处理后7 d表达于毛囊的毛母质；Lef1表达于AdWnt10b诱导再生毛囊的毛芽及毛母质部位，且为核表达；Ki67表达于AdWnt10b诱导再生毛囊隆突区，且为核表达。虚线示毛囊结构轮廓

三、Wnt10b诱导再生毛囊的增殖特性

AdWnt10b处理后2.5 d即可见Ki67表达，其表达部位包括表皮和毛囊外根鞘。其中，处理后2.5、7、9、14 d均在隆突区见到Ki67的表达，但并不是所有隆突区细胞均有Ki67表达。从处理后7 d开始，Ki67表达于毛母质细胞。AdGFP组在2.5 d时有零散的Ki67表达，以后一直未见Ki67表达。见图2。

讨 论

关于Wnt信号通路在毛囊周期中的作用研究已有报道，DKK1是Wnt通路的抑制剂，胚胎发育时持续过表达DKK1，则不能生成毛囊，在出生后过表达DKK1则抑制毛囊生长［6］。在突变缺失Lef1小鼠，不能形成触须，且体毛数量明显减少［7］，而在表皮过表达Lef1将导致异位生成毛囊［8］。新分离的真皮乳头细胞（DP细胞）能够诱导毛囊bulge细胞（毛囊干细胞）形成新的毛囊，而在培养后，此诱导功能消失，当在培养基中加入Wnt时，则能够相对保持此诱导活性［9］。本课题组前期研究发现，AdWnt10b过表达能够诱导毛囊的周期性再生，同时，腺病毒介导的Wnt5a能够抑制毛囊的再生［10］。本研究对AdWnt10b诱导再生的毛囊进行深入研究，结果显示，AdWnt10b诱导再生的毛囊有正常的毛囊结构，且能够正常进入下一个毛囊周期。说明Wnt10b对于启动毛囊生长的作用具有潜在的应用价值。

AE15是毛囊内根鞘的特异性标记物，在毛囊生长期中出现，退化期中逐渐减少，在毛囊静止期时消失。本研究发现，在AdWnt10b处理后5 d开始，处理部位出现AE15，在处理后28 d开始，AE15表达减少，说明AdWnt10b诱导生长的毛囊，可能从28 d开始进入退化期，这与正常小鼠发育不同。正常小鼠的毛囊是19 d即进入退行期，22 d全部进入休止期，其原因可能为我们采用了腺病毒作为表达载体，而腺病毒在体内的作用时间可以长达1个月，只是后期作用强度逐渐降低。Ki67是增殖细胞的标记物，本研究发现，AdWnt10b处理组毛囊隆突区的部分细胞表达Ki67，说明有部分毛囊干细胞处于增殖状态，即这部分毛囊干细胞被AdWn10b激活。

经典Wnt信号通路激活LEF/TCF转录复合物后，启动下游基因的转录。其靶基因有多种，在诱导毛囊周期性再生时，具体激活什么靶基因，还有待研究。Wnt10b是分泌性糖蛋白，经过严格调控的处理加工后被细胞分泌出细胞外，在细胞外基质中运输，通过自分泌或旁分泌形式发挥作用［11］。研究发现，Wnt蛋白分泌作用的范围可以达到周围直径20～30个细胞距离［12］。前期研究发现，在正常毛囊周期中，Wnt10b表达于生长期的毛母质细胞，在退化期和静止期均无特异性表达［13］。因此，临近毛母质的毛囊细胞及毛乳头细胞均有可能是Wnt10b可能的靶细胞，从生物体能量节约的原则考虑，最有可能的靶细胞或许是毛母质细胞本身和邻近的毛乳头细胞。本研究中，采用过表达的方式发现，AdWnt10b处理后，发生增殖的细胞是毛囊干细胞，而不是毛乳头细胞，说明Wnt10b的靶细胞是毛囊干细胞，而在生长期启动后，毛母质也处于增殖状态，说明Wnt10b也作用于毛母质细胞。因此，本研究明确了Wnt10b作用的靶细胞，即毛囊干细胞及其子代细胞。当然，增加干扰Wnt10b的实验更具有说服力，将在以后进一步研究。

总之，本研究系统研究了AdWnt10b诱导再生毛囊的结构特征、信号通路表达特征及增殖特性，发现AdWnt10b所诱导再生毛囊具有正常的毛囊结构及毛囊周期，为开发毛囊周期性再生障碍相关疾病的治疗药物提供依据。本研究还明确了Wnt10b作用的靶细胞是毛囊干细胞及其子代细胞，为进一步深入研究奠定了基础。

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Expression characteristics in regenerating hair follicles induced by Wnt10b

Xing Yizhan,Guo Haiying,Ma Xiaogen,Li Yuhong
Department of Cell Biology,College of Basic Medical Sciences,Third Military Medical University,Chongqing 400038,China

ObjectiveTo investigate expression characteristics in regenerating hair follicles induced by Wnt10b,and to explore mechanisms underlying Wnt10b-induced regeneration of hair follicles.MethodsBoth adenovirus containing the Wnt10b gene（AdWnt10b）and that containing the green fluorescent protein-encoding gene（AdGFP）were amplified in HEK-293 cells and purified by caesium chloride density gradient centrifugation.A total of 36 C57BL/6J mice were randomly and equally divided into the AdWnt10b group and AdGFP group to be intracutaneously injected with AdWnt10b and AdGFP on the back respectively.Three mice were sacrificed on day 2.5,5,7,9,14 and 28 after the injection separately,and skin samples were resected from the injected sites subsequently.Hematoxylin and eosin（HE）staining and immunohistochemical staining were performed to observe hair follicle structure,analyze expression characteristics of the Wnt signaling pathway,and to estimate proliferative activity of regenerating hair follicles induced by Wnt10b.ResultsAs HE staining showed,new hair follicles appeared as early as day 5 after the injection,then grew normally,and entered into catagen phase on day 28 in the AdWnt10b group.Immunohistochemical staining showed that AE15 expression was observed in new hair follicles as early as day 5 after the injection in the AdWnt10b group,then increased along with the growth of hair follicles,but decreased on day 28.On day 5 after AdWnt10b injection,both βcatenin and Lef1 expressions were seen in the cell nucleus.Lef1 was expressed specifically in hair germs and hair matrix,and its expression began to decrease on day 28.In addition,Ki67 expression was observed in the epidermis and outer root sheath of hair follicles as early as day 2.5 after the injection,in the bulge region of hair follicles on day 2.5,7,9 and 14,and in hair matrix cells as early as day 7.ConclusionWnt10b could induce regeneration of hair follicles with normal structure,likely by activating the canonical Wnt signaling pathway in hair follicle stem cells and their daughter cells.

Hair follicle;Regeneration;Stem cells;Wnt signaling pathway;Ki-67 antigen;beta Catenin

Li Yuhong,Email:liyuhongtmmu@hotmail.com

李玉红，Email：liyuhongtmmu@hotmail.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2016.04.008

国家自然科学基金（81472895）；重庆市自然科学基金（cstc2013jcyjA10084）

Fund programs:National Natural Science Foundation of China（81472895）;Chongqing Municipal Natural Science Foundation（cstc2013jcyjA10084）

2015-09-25）

（本文编辑：颜艳）