天津地区奶牛乳房炎葡萄球菌的分离鉴定及药敏试验

2016-10-28马腾宇陈丽丽白娜仁吐雅

中国乳业 2016年9期

文/马腾宇　陈丽丽　汪　志　白娜仁吐雅

文/马腾宇1陈丽丽2汪志3白娜仁吐雅3

（1天津食品集团有限公司；2天津市奶牛发展中心；3天津嘉立荷畜牧有限公司）

通过血平板培养、革兰氏染色、生化鉴定试验，对天津地区由葡萄球菌引起的奶牛乳房炎进行分离鉴定，并对其进行耐药性分析。结果显示，采集199 份奶样中共检出葡萄球菌53 株，其中金黄色葡萄球菌40 株、表皮葡萄球菌13 株；检出的葡萄球菌对头孢噻肟、环丙沙星、恩诺沙星、丁胺卡那霉素高度敏感，可以用以上4 种抗生素对由葡萄球菌引起的奶牛乳房炎进行治疗。

奶牛；乳房炎；葡萄球菌；药敏试验

奶牛乳房炎与子宫炎、肢蹄病被称为奶牛三大难治愈的疾病，是奶牛的一种常见病与多发病，只要饲养奶牛的地方，就有乳房炎发生。乳房炎是奶牛乳腺组织受到病原体的侵袭及物理、化学因素刺激所发生的一种炎症反应，该病的发生给奶牛养殖业造成了非常大的损失［1］。奶牛乳房炎可由多种病原微生物引起，包括细菌、霉形体、真菌和病毒等，一般以细菌感染为主，其中葡萄球菌是导致奶牛乳房炎的最主要病原菌，链球菌和大肠杆菌也比较常见［2～4］。

据统计，世界范围内，每年因奶牛患乳房炎导致的奶产量下降可达380 万吨［5］。因此对奶牛乳房炎采取适当治疗、对症用药，减少产奶量损失，对国际奶业的发展具有重要意义。奶牛乳房炎一般采用抗生素治疗，杀灭侵入组织的病原体，并消除炎症反应。常用的抗菌药物有青霉素、链霉素、卡那霉素、氯霉素、红霉素、四环素、磺胺类及喹诺酮类药物等［6］。本研究对天津地区引起奶牛乳房炎的葡萄球菌进行分离、鉴定，并进行药敏试验，为指导临床科学用药，有效降低乳房炎的发病率，促进奶牛养殖业的健康持续发展提供科学依据。

1　材料与方法

1.1试验材料

1.1.1奶样采集

在天津周边的大港区（位于天津的南部）、静海区（位于天津的西部）、宝坻区（位于天津的北部）不同规模奶牛场选取患乳房炎病牛，其中在大港区3 个牛场中选取20 头、静海区2 个牛场中选取10 头，宝坻区地理分布不同的4 个牛场中选取20 头。一共采集了9 个牛场199 份奶样，其中大港地区80 份奶样，静海地区38 份奶样，宝坻地区81 份奶样。

先用温水清洗乳房，擦干后用浸有消毒药液，如0.2%新洁尔灭溶液的湿毛巾擦拭乳房，待皮肤干燥后再以75%酒精棉消毒乳头口及其周围。清洗消毒后，每个乳头挤出三把奶弃掉，以排除一些污染的杂菌，然后以无菌操作的方法，从奶牛的每个乳室中，现挤5～10 mL乳汁，装入灭菌试管或无菌小瓶内，封好盖，标上牛号、乳室、日期等，保存于放有冰块的保温箱中，24 h内检验。

1.1.2试验用品

（1）血琼脂平板

血琼脂平板用于分离培养葡萄球菌。由天津嘉立荷畜牧有限公司提供的绵羊，颈部静脉采血，用无菌方法分离血液中的纤维蛋白，再以5%的比例溶于50～60 ℃的营养琼脂中，冷却后置4 ℃冰箱备用。

（2）却甫曼琼脂培养基

却甫曼琼脂培养基内含7.5%NaCl，以抑制葡萄球菌以外的其它细菌生长，用于选择分离葡萄球菌。

（3）营养肉汤

营养肉汤用于增菌培养。

（4）药敏试纸片

丁胺卡那霉素、红霉素、环丙沙星、青霉素、庆大霉素、氟哌酸、链霉素、恩诺沙星、四环素、氨苄西林、头孢噻肟、克林霉素、复方新诺明12 种新药敏纸片，均购自杭州微生物试剂有限公司。

1.2试验方法

1.2.1细菌分离培养

将采取的乳样置于无菌离心管中，2 000～3 000 r/min离心10 min，弃去管中上层液体，无菌吸取底部沉淀物1 mL，加入含5 mL的营养肉汤的玻璃管中，置于摇床上，增菌培养24 h；挑菌在却甫曼琼脂培养基上进行划线，于37 ℃下培养12～24 h后，挑取典型单个菌落接种到绵羊鲜血琼脂平板上再次培养12～24 h，观察细菌生长情况，并进行革兰氏染色，配合显微镜检查，观察细菌形态、革兰氏染色特点，挑选出单个菌落接种到却甫曼琼脂培养基上进行纯培养。

1.2.2细菌生化鉴定

纯化培养后的细菌进行触酶试验、溶血试验、凝固酶试验、麦芽糖发酵、甘露醇以及七叶苷水解试验，参照《常见细菌系统鉴定手册》［7］进行鉴定。

1.2.3药敏试验

（1）在良好的光线下，以有黑字的白纸为背景，将培养液（菌悬液）与硫酸钡标准管进行比浊，调整浑浊度至硫酸钡标准管相同浓度。如细菌浓度过高，用灭菌生理盐水稀释培养液。

（2）将溶化好的M-H琼脂倾注直径90 mm的平皿，制成厚3～4 mm的M-H琼脂平板。

（3）用灭菌棉拭子蘸取上述浓度的菌悬液，在管内壁将多余菌液挤去，在琼脂平板表面涂布接种3 次，每次旋转60°，最后沿平板内缘涂抹一周，使菌液均匀涂满整个琼脂平板表面，盖好平皿，在室温下干燥5 min，待平板表面稍干即可放置药敏片。

（4）用灭菌镊子以无菌操作，夹住药敏片边缘取出，紧贴在涂有细菌的平板培养基表面。贴药敏片时要轻轻按压，以保证与培养基密切接触。将平皿置于35～37 ℃温箱中培养12～24 h，观察结果。

图1　葡萄球菌在血琼脂平板上的菌落特征

图2　葡萄球菌在却甫曼琼脂培养基上的菌落特征

图3　葡萄球菌纯培养物涂片革兰氏染色阳性

2　结果

2.1葡萄球菌的分离与鉴定

葡萄球菌在普通营养肉汤中迅速生长，浑浊率高，管底部有沉淀；在血琼脂平板上生长良好，呈圆形或椭圆形，多成簇，也有成对和单个者，菌落直径1.5～2.0 mm，有的菌落呈米黄或金黄色，有的菌落呈乳白或灰白色，均不透明，表面光滑，边缘整齐（图1）；在却甫曼琼脂培养基上，生长初期基本和在血琼脂平板上的状态一样，3 天后，葡萄球菌呈圆形、黄玉米色、边缘整齐的小菌落（图2）。纯化后的细菌革兰氏染色后镜检显阳性，呈圆形，以单个或短链状、葡萄串状排列（图3）。

2.2葡萄球菌的生化鉴定

表1列出了2 种葡萄球菌的生化鉴定结果，触酶试验呈阳性，β溶血，凝固酶阳性，麦芽糖阳性，甘露醇阳性，七叶苷水解试验阴性，判断为金黄色葡萄球菌；触酶试验呈阳性，γ溶血，凝固酶阴性，麦芽糖阴性，甘露醇阴性，七叶苷水解试验阴性，判断为表皮葡萄球菌。

2.3天津地区葡萄球菌检出率

天津市3 个区县9 个奶牛场199份奶样中共检出葡萄球菌53 株，其中金黄色葡萄球菌40 株，表皮葡萄球菌13 株，具体检出结果及检出率见表2。

2.4药敏试验

对分离鉴定出的2 种葡萄球菌进行药敏试验，结果如表3所示。从表3可以看出，头孢噻肟、环丙沙星、恩诺沙星、丁胺卡那霉素、氟哌酸、四环素对葡萄球菌均有高抑制性；氨卞西林、庆大霉素、克林霉素和复方新诺明对葡萄球菌有抑制作用；葡萄球菌对青霉素、链霉素以及红霉素基本耐药。

表1　葡萄球菌生化鉴定结果

表2　葡萄球菌检出数量及检出率

表3　葡萄球菌药敏试验结果　　　　　　　　　　　　　单位：mm

3　讨论

3.1葡萄球菌的分离鉴定

本试验中，采集的199 份奶样中，共检出葡萄球菌53 株，这与马保臣报道的泌乳期临床型乳腺炎病原菌以凝固酶阴性葡萄球菌为主［8］，周庆国报道的佛山地区4 个奶牛场中的奶牛临床型乳房炎主要由链球菌、葡萄球菌和大肠杆菌感染而引起［9］基本相符。

从引起奶牛乳房炎病原菌的检出率分析，本试验中金黄色葡萄球菌检出率为20.10%，表皮葡萄球菌检出率为6.53%，这与张中文报道的临床型乳房炎北京部分地区葡萄球菌占23.81%［10］，殷波报道的四川某奶牛场临床型乳房炎的病原菌检出率金黄色葡萄球菌23.3%、表皮葡萄球菌3.3%［11］，袁永隆报道的临床型乳房炎中葡萄球菌占17.14%［12］基本一致，但不同地区学者们检测出引起奶牛乳房炎的葡萄球菌的检出率存在细微差别。

3.2葡萄球菌的药敏试验

从上述试验结果可知，引起天津地区奶牛乳房炎的葡萄球菌对头孢噻肟、环丙沙星、恩诺沙星、丁胺卡那霉素高度敏感，为了有效控制此种病原菌引起的奶牛乳房炎，以上4 种抗生素为首选药物。本试验研究结果与王登辉报道的乳样中分离出的金黄色葡萄球菌对头孢和环丙沙星敏感［13］相一致，与马晓艳等研究金黄色葡萄球菌对环丙沙星、恩诺沙星高度敏感结果［14］也相吻合，但与李飞等研究表明金黄色葡萄球菌对复方新诺明耐药率在80%以上的结果［15］稍有差异。